以下の記事は、2017年10月30日にThe Cell Culture Dishに掲載されたものを翻訳したものです。
器官形成や疾患モデル構築、さらにその先の新規治療薬開発の研究進展を支援する「ミニ臓器」作製法として、この10年間にオルガノイド培養が急速に普及しています。これまでに研究室で作り出された培養ミニ臓器（器官）としては、腎臓、肝臓、脳、前立腺、膵臓があり、いずれも本物の臓器の組成・機能に非常に類似しています。
オルガノイド培養に使えるプロトコールやツール、手法には、マイクロプレートや細胞外基質（ECM）、ハイドロゲル、バイオプリンティングからマイクロ流体技術に至るまで多数あります。膨大な選択肢の中から、扱う細胞タイプや研究領域、最終ゴールに合わせて選定するのは、決して容易ではなさそうです。
では選定作業はいったいどこから着手すればいいのでしょうか。やはり過去の実験から得られた知見を生かすことが、出発点として最適です。そこで今回は、コーニング ライフサイエンスの専門家を招き、オルガノイド関連の疑問に回答していただきました。コーニングは、3D細胞培養の分野で30年以上の実績があり、Corning® マトリゲル基底膜マトリックス、Transwell® パーミアブルサポート、Corning スフェロイドマイクロプレートなど、最も広く使われている独自の3Dツールを取り揃えています。
今回お招きしたコーニングの専門家は、Feng Li（シニア開発サイエンティスト）、Hilary Sherman（アプリケーションサイエンティスト）、Himabindu Nandivada（シニア開発サイエンティスト）、Nitin Kulkarni（シニアサイエンティフィックサポートスペシャリスト）の各氏です。Feng Li博士は、肝毒性・肝疾患モデル構築のための3D肝臓モデルシステムの研究に従事してきました。最近の研究には、肝臓3Dスフェロイド培養手順の確立、3Dスフェロイド培養のためのヒト初代肝細胞（PHH）試験、Corning 超低接着表面スフェロイドマイクロプレート上のPHHスフェロイドを用いた慢性肝毒性試験・反復投与のアッセイ開発があります。Hilary Sherman氏は、コーニング ライフサイエンスアプリケーションサイエンティストです。3D培養を含む多様なアプリケーションで哺乳類、昆虫、初代細胞、幹細胞など多様な細胞タイプの研究に従事しています。Nandivada博士は、ヒト多能性幹細胞培養や材料工学の分野で10年以上の経験があります。Kulkarni博士は、数年前からサイエンティフィックサポートグループの一員として、3D細胞培養のサポートに当たっており、先ごろオルガノイド培養に用いる表面について講演・ウェビナーを担当しました。
スフェロイドとオルガノイドでは、培養表面の要件はどう異なりますか。
スフェロイドは、単一または複数のタイプの細胞が集まった凝集塊であり、細胞同士が接着してスフェロイドを形成しますが、培養表面には接着しません。超低接着表面スフェロイドマイクロプレートは、スフェロイドの形成とアッセイが同じマイクロプレート上で行える理想的なツールです。一方、オルガノイドは、分化と自己組織化によって3D構造を形成するもので、対象臓器に類似し、少なくとも部分的には対象臓器と同じ機能を持ちます。オルガノイドに自己組織化するには、Corning マトリゲル基底膜マトリックスやコラーゲン Iなどの細胞外基質への接着と特異的な発生シグナルが必要です。
オルガノイド培養に適した動物由来成分フリーか合成の表面はありますか。
オルガノイド培養に使われている動物由来の細胞外基質で特に定評があるのは、Corning マトリゲル基底膜マトリックスです。オルガノイド培養用の合成マトリックスの開発については、マトリゲル基底膜マトリックスの形態や機能性と比較した研究の報告がいくつかあります。特定のオルガノイドやアプリケーションで合成マトリックスの作製に成功しており、進行中の研究も多数あります。例としては、以下の参考文献が挙げられます。
Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture
Neural tube morphogenesis in synthetic 3D microenvironments
ハイスループット薬剤スクリーニング環境にオルガノイドを適合させる効率的な方法はありますか。
オルガノイドを使ったハイスループットスクリーニングは新しい技術で、研究者の間ではこれを使いこなす効率的な方法が求められています。Corning マトリゲル基底膜マトリックスは、オルガノイドのワークフローで定番のマトリックスであり、さまざまなタイプのオルガノイドの増殖に非常に適しています。HTSフォーマットにオルガノイドを播種する際に一般的な手法は2つあります。1つは「サンドイッチ法」で、マトリゲル基底膜マトリックスを所定のプレートフォーマットに分注して重合させます。その後、オルガノイド細胞懸濁液に希釈したマトリゲル 基底膜マトリックスを混合して重合層の上に分注し、さらにインキュベートする方法です（Cell 2015 161, 933–945）。もう1つは、オルガノイド細胞にマトリゲル基底膜マトリックスを混合し、ロボットプラットフォームで対象となるHTSフォーマットに分注します。その際、プレートは冷却しておきます（Journal of Biomolecular Screening 2016 Vol. 21(9) 931–941）。その後、2〜3日間、前培養してから薬剤化合物で検証します。また、Corning 96ウェルスフェロイドマイクロプレートを利用して、iPS細胞スフェロイドを分化させてから、Corning マトリゲル基底膜マトリックスを重層することにも成功しています。この手法では、各ウェルで単一オルガノイドを形成できます。エンドポイントが顕微鏡検査であれば、イメージング対応のプレートフォーマットが理想的です。コーニングでは、多彩なイメージング対応プレートを揃えており、丸底、平底、スフェロイド形成用丸底の各フォーマットがあります。また、こうした3D培養の薬物毒性の評価には、生存率測定アッセイが使われています。
オルガノイドの免疫染色について、ベストプラクティスのアドバイスをいただけますか。
オルガノイドは、ハイドロゲルや細胞外基質から回収するか、マトリックスと濃度によりますが、マトリックスのまま染色することも可能です。Corning マトリゲル基底膜マトリックスからオルガノイドを回収する場合、培養物をCorning セルリカバリーソリューション（ディスパーゼはシングルセル懸濁液を作ることになるので、それが目的の場合以外は使用しません）で処理してオルガノイドを取り出してから、固定、透過処理、染色を行います。別の方法としては、マトリゲル基底膜マトリックスのオルガノイドを直接染色することもできます。この方法では、バックグラウンドが高くなりやすいため、ブロッキング条件や洗浄を調整して最適なS/N比にする必要があります。免疫染色時のバックグラウンドを下げるには、フェノールレッドフリーのマトリゲルの使用をお勧めします。多くの場合、透過処理や染色の際に濃度を高くする必要があり、その分、オルガノイド全体に浸透するまでインキュベーションのステップが長くなります。処理前にオルガノイドを包埋する場合、組織学的解析のためのスフェロイドの処理・包埋の指針をまとめたプロトコール（CLS-AN-431）がコーニングから提供されています。Visikolは、免疫標識された3D構造の可視化を向上させる透明化試薬です。包埋・組織化された標本の抗原賦活化とその後の染色プロトコールの条件は、標的抗原に合わせて最適化する必要があります。以下の参考文献をご覧ください。
オルガノイド培養で最も大きな課題は、とりわけオルガノイド形成時の栄養供給とガス交換だと感じています。ご意見やアドバイスをいただけますか。
オルガノイドは、培養物のサイズが大きくなる一方、ご質問にもあったように、血管新生されないことから、新鮮な栄養分の連続的な供給と老廃物の除去が必要です。この目的での推奨事項は3つあります。
Corning マトリゲル基底膜マトリックス液滴に包埋し、その後、Corning スピナーフラスコで培地に懸濁する手順で、多くの研究者がオルガノイドの培養・維持に成功しています。Lancaster氏とKnoblich氏は、4 mmサイズの脳オルガノイドを最長15カ月維持することに成功しました。プロトコールについては、こちらの文献をご覧ください。
私たちは、2 mmのオルガノイドで頻繁（週2〜3回）に培地を交換することで、腸オルガノイドの培養に成功し、最長6週間維持しました。McCrackenらは、こちらのプロトコールで、こうしたオルガノイドを最長140日間に渡って継代しました。
連続的な栄養分補給と老廃物除去の方法としては灌流もあります。実際、臓器チップ培養では、栄養分、増殖因子、代謝産物が最適化された段階で、すべてを常に平衡状態に保つために灌流を利用するケースが増えています。こうすることで、静置培養よりはるかに長期間、培養物が維持できるようになります。
オルガノイド培養は時間的にどのような過程で進行しますか。形成初期の兆候、継代や培地交換のタイミングについて教えてください。
オルガノイドの発生の進行や、オルガノイド培養の各ステップのタイミングは、細胞の起源や使用するプロトコール（培地組成など）、目的のオルガノイドタイプによって異なります。プロトコールによっては、オルガノイド培養プロセス開始から早ければ24時間でオルガノイド様構造や発芽が観察されます。例えば、ヒト多能性幹細胞から脳オルガノイドを作製する過程では、胚様体（EB）をマトリゲル基底膜マトリックスに播種後1〜3日以内に、神経上皮芽が観察されました（Lancaster and Knoblich, Nat Protoc, 2014）。長期的な分化・成熟化過程は、数週間から数カ月に及ぶこともあります。
このトピックに関連して参考になりそうな総説論文がいくつかあります。
オルガノイドに最適な培養容器を紹介してください。イメージングに適した容器も併せてお願いします。
オルガノイド培養に使う培養容器のタイプは、オルガノイドに用いるプロトコールによって異なります。オルガノイドの作製、培養、特徴付けの各段階でさまざまな培養容器が使われます。TC（組織培養）処理済み容器（マルチウェルプレートやディッシュ）は、天然ハイドロゲル（Corning マトリゲル基底膜マトリックス、コラーゲン、ラミニン/エンタクチン）か合成ハイドロゲルと組み合わせて、静置培養でオルガノイド形成・培養を開始するのに使うことができます。また長期オルガノイド培養には、オービタルシェーカーやスピナーフラスコのような攪拌培養システムも利用されています（Lancaster and Knoblich, Nat Protoc, 2014）。オルガノイドの作製・培養には、Corning スフェロイドマイクロプレートが利用できます。オルガノイドは、プレートから重力と表面張力で垂れ下がった液滴を使う（懸滴法）か、Corning 超低接着表面プレートを使った培地液滴でも培養されています（Hohwieler M, et al.Gut, 2017, Shamir and Ewald, Nat Rev Mol Cell Biol, 2014）。
イメージング向けに、コーニングから、ハイスループットイメージング処理に対応する96ウェルフォーマットと384ウェルフォーマットのさまざまなマイクロプレートが提供されています。
今、Corning マトリゲル基底膜マトリックスでiPS細胞由来の腸オルガノイドを培養しています。今後、テストや分析のためにマトリックスからオルガノイドを回収するつもりです。お薦めの回収プロトコールはありますか。
Corning マトリゲル基底膜マトリックスからオルガノイドを回収する場合、Corning セルリカバリーソリューション 100mL（製品番号#354253）がおすすめです。96ウェルのスフェロイドマイクロプレートで培養する6週オルガノイドの場合の一般的なガイドラインは次のとおりです。最良の結果を出すには、インキュベーション時間を最適化するのがよいでしょう。
- 150 µLの冷却PBSでウェルを2回洗浄する（オルガノイドは重力か遠心で沈降可能）。
- 96ウェルスフェロイドマイクロプレートに、冷却したCorning セルリカバリーソリューションを1ウェル当たり150 µL加える。
- 4°Cで1時間インキュベートする。
- 150 µLの冷却PBSでオルガノイドを1回洗浄する。
- 新しい培地か希望する緩衝液にオルガノイドを再懸濁し、次の分析に使用する。
オルガノイドを用いた内皮細胞との共培養に関する研究についてご意見をうかがいたいのですが。オルガノイドは、良質な培養培地であれば十分な栄養分を獲得できるでしょうか。
現時点では、in vivoのオルガノイドが独自の血管構造を持つ例はありませんが、肝芽など一部のオルガノイドで、内皮細胞が未発達の血管構造を形成することが観察されています。これを免疫不全マウスに移植すると、宿主の血管系が移植構造と融合し、機能的血管網を形成し、最終的にマウスに機能的肝芽を形成します。詳細については、こちらの論文をご覧ください。内皮細胞とMSCにiPS細胞を混合、あるいは血管構造を3D構造にバイオプリンティングする研究は多数あります。ほかにも、こちらの文献に記載の肝細胞スフェロイドのように、内皮細胞を共培養スフェロイドで機能強化した例もあります。
もう1つのご質問ですが、オルガノイド培養に培地を最適化した後は、スピナーフラスコか灌流か頻繁な培地交換で、十分な栄養分供給と老廃物除去が可能です。オルガノイドは、培養でサイズが大きくなる一方、血管新生されないことから、新鮮な栄養分の連続的な供給と老廃物の除去が必要です。この目的では以下の3つの方法を推奨します。
- Corning マトリゲル基底膜マトリックス液滴に包埋し、その後、Corning スピナーフラスコで培地に懸濁する手順で、多くの研究者がオルガノイドの培養・維持に成功しています。LancasterとKnoblichは、4 mmサイズの脳オルガノイドを最長15カ月維持することに成功しました。プロトコールについては、こちらの文献をご覧ください。
- 私たちは、2 mmのオルガノイドで頻繁（週2〜3回）に培地を交換することで、腸オルガノイドの培養に成功し、最長6週間維持しました。McCrackenらは、こちらのプロトコールで、こうしたオルガノイドを最長140日間に渡って継代しました。
- 連続的な栄養分補給と老廃物除去の方法としては灌流もあります。実際、オーガンオンチップ培養では、栄養分、増殖因子、代謝産物が最適化された段階で、すべてを常に平衡状態に保つために灌流を利用するケースが増えています。こうすることで、静置培養よりはるかに長期間、培養物が維持できるようになります。
オルガノイドのサイズや稠密度は、栄養分と酸素の供給で重要な役割を担います。オルガノイド内部に栄養分や酸素を供給する際に、受動拡散だけに頼るのは限界があります。このため、スフェロイド内部の細胞の代謝状態には大きな差が生じやすくなります。従来のスフェロイドより大型で腫瘍に近い性状を示す腫瘍オルガノイド（tumoroid）研究を例に取ると、内部で壊死が生じ、低酸素応答の徴候が見られます。このため、栄養分と酸素の供給については、オルガノイドタイプ、培地、その他の培養条件といった要因をすべて検討する必要があります。
スフェロイドとオルガノイドの違いは何ですか。また、それぞれの用途を教えてください。
スフェロイドとオルガノイドは、複数の細胞から成る3D構造体です。どちらも同じような意味で使われていますが、両者には明確な違いがあります。オルガノイドは「幹細胞または臓器前駆細胞から発現し、in vivoと同様の細胞選別や空間的に限定された分化系列決定を通じて、自己組織化する臓器特異的細胞型の集合体」と定義されます（Science2014.：345:124）。一方、多細胞腫瘍スフェロイドモデルは、70年代初頭に初めて報告され、非接着条件下でのがん細胞株の培養により得られました（J. Natl. Cancer Inst. 1971. 46:113）。腫瘍様塊は、がん幹細胞増殖モデルです。組織由来の腫瘍塊と器官型多細胞スフェロイドは、主に腫瘍組織の機械的な解離・切断により得られます（Neoplasia (2015) 17, 1–15）。一般に、オルガノイドは、スフェロイド培養よりも高次の自己凝集化があり、オルガノイドの方が形成時にマトリックスへの依存度が高くなります。
オルガノイドは近年、モデルとして大きな注目を集めています。とりわけ、2D共培養系に比べて、あるいは3D共培養系と比べても、優れたin vitroモデルになるからです。オルガノイド研究で特に関心を集めている領域としては、臓器発生、薬剤スクリーニング、疾患モデル構築、毒性試験があります。オルガノイドの登場で、研究者がin vitroモデルをさらに究めることになると期待されています。最近のオルガノイド関連文献についてまとめた文献レビューをいくつか挙げておきます。
Yin, Xiaolei, et al. "Engineering stem cell organoids." Cell stem cell 18.1 (2016): 25-38.
オルガノイド培養に特別な培地要件はありますか。それともその細胞タイプの特異的ニーズに対応するだけで十分ですか。
SatoとCleversの最近の論評にあるように、関心対象のオルガノイドによって異なります。研究者は、肝臓オルガノイド（Xia Y. et al. (2014) Nature Protocols. 9:2693）（Freedman B. et al. Nat Commun.2015; 6: 8715）、脳オルガノイド（Lancaster M.A. and J. A. Knoblich (2014) Nat.Protocols. 9:2329）、肺オルガノイド（Dye B.R. et al. (2015) eLIFE. 4:e05098）（Nikolick and Rawlins, Curr Pathobiol Rep. 2017; 5(2): 223–231）など、臓器ごとに好みのオルガノイド培地を開発・最適化しています。一般的には、2D単層分化法に用いる培地に変更や最適化を実施したものから始めることをお勧めします。
薬理試験用のミニ臓器としてのオルガノイド利用に成功している証拠はありますか。そういう考え方があることは知っていますが、実際に成功している方はいるのでしょうか。
薬剤スクリーニングへのオルガノイド利用については関心が高まっており、製薬業界ではプラットフォームとしての利用も検討されています。しかし、この技術を薬剤スクリーニングに標準的に使用するには、まだ克服しなければならない課題が山積しています。嚢胞性線維症（CF）患者のうち、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の変異を持つ患者について最初の成功事例が報告されています。Vriesの研究チームは、さまざまなCFTR変異の患者の直腸上皮からオルガノイドを作製し、Vertex Pharmaceuticals製のアイバカフトール（ivacaftor）とルマカフトール（lumacaftor）の2剤に対するオルガノイドの腫脹を測定しました。その結果、希少なCFTR変異を持つ2患者のオルガノイドが、同剤に反応することがわかりました。in vitroでの成功を足掛かりに、同患者にこれらの薬剤を投与したところ、良好な反応が見られました。これは、オルガノイド反応の現象と患者の生理的反応の相関が見られた初の成功事例です（Science Transl. Med. 2016. Vol 8, Issue 344:344ra84; Nature Rev. Drug Discov. 2017. 16: 6-7）。
詳細については、「オルガノイドモデル」をご覧ください。
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