細胞凍結保存ガイド

細胞タイプごとに適切な手順で、できる限り丁寧に細胞を回収します。細胞を回収したら、細胞に損傷を与える恐れのある剥離剤を洗い流すか不活化します。どうしても必要な場合以外は、遠心機の使用を避けます。やむなく使用する場合は、ゆるいペレットが形成される程度の遠心にとどめてください。

回収した培養容器の中身はプールし、最終的な凍結ストックの均一性を確保します。細胞懸濁液は、所望の濃度の2倍になるように、希釈または濃縮します。

細胞代謝を遅らせて凝集を防止するために、細胞は冷却してください。pHがアルカリ性にならないようにする必要がある場合には、二酸化炭素を充填します。

凍結保存中の細胞損傷を防止（少なくとも最低限に抑制）するには、適切な凍結保護剤（CPA）を選定することが大切です。適切な保管容器を選ぶことも重要です。容器の選択を誤ると、怪我、容器の損傷、凍結ストックのコンタミネーションや損失など、さまざまなリスクが生じます。凍結保存用の容器としては、ヒートシール型のガラスアンプルやポリプロピレン製スクリューキャップバイアル（内ネジ式、外ネジ式）が最も普及していますが、前者はシーリングの手間があることから、研究者や業界専門家の間では後者の人気が高まっています。

冷却速度は乱れなく一定の速度を維持する必要があります。また、速度は速すぎると細胞が脱水するのに必要な時間を確保できません。逆に遅すぎると今度は細胞が脱水によるダメージを受けてしまいます。ほとんどの動物細胞培養では、安定的に毎分1°C～3°C降下するのが理想的な冷却速度です。大型あるいは透過性の低い細胞は脱水に時間がかかるため、冷却速度をさらに遅くする必要があります。

プログラム可能な電子冷却装置を使用している研究室もあります。これは凍結プロセスを正確に制御できるため、均一で再現性のある結果が得られます。機械式の冷却装置は、手ごろな価格ながら十分にプロセスを制御できます。細胞株凍結で最も経済性に優れていて広く普及しているのは、断熱性のある発泡スチロール箱に入れて超低温フリーザーで保管する方法です。

ストックが凍結したら、次の作業は素早く行います。ドライアイスか液体窒素を詰めた断熱コンテナで凍結ストックを永久保管庫に運びます。バイアルの温度上昇や細胞への損傷を回避するには、スピードが重要です。

ほとんどの細胞培養研究室では液体窒素フリーザーを使用していますが、長期凍結保管場所で最も重要な機能は、−130°C以下の温度を確実に維持できることです。一時的に温度が上昇するだけでも、細胞に損傷を与えかねません。

細胞は徐々に冷却する必要があります。一方で、細胞融解時はこれとは逆に速やかに行います。細胞が再水和する際、細胞損傷の原因となる氷晶が細胞内に形成されますが、急速融解によってこの形成を抑えることができます。コンテナを温浴し、完全に融解されるまで静かに揺らします。ほとんどの細胞は、37°C、60～90秒間の融解で最良の結果が得られます。

細胞が長時間、凍結保護剤に曝露されると損傷の原因になるため、なるべく迅速に、しかも丁寧に、細胞から凍結保護剤を取り除きます。凍結保護剤の除去方法は、保護剤のタイプと細胞タイプによって異なります。例えば、凍結保護剤に対する感受性の高い細胞であれば、低速の遠心で保護剤を除去する必要があります。凍結保護剤にグリセロールを使う場合、融解した細胞懸濁液に大量の新鮮培地を急激に加えると、細胞の損傷や破壊を招く恐れがあります。このような事態を回避するため、同量の温めた培地を10分おきに数回に分けて加えて段階的に希釈し、細胞が適応する時間を確保してから、必要な処理を行います。

通常、融解から6～8時間以内に培地交換で凍結保護剤が除去されれば、ほとんどの細胞は正常に回復します。

適切に保存されていれば、凍結細胞のメンテナンスはほぼ不要で、コンタミネーションや過失で細胞培養を失ってしまった場合のバックアップになります。凍結した培養細胞は、仮死状態にあり、生物学的変異を最小限に抑えられることから、特に長期実験に有効です。