What is Transfection? A Practical Guide

核酸を生細胞や生物個体に導入する手法について、研究現場では文脈によっていくつかの用語を使い分けています。その具体例をいくつか挙げてみましょう。

• 主にウイルスを使わない手法による動物細胞への核酸導入は、トランスフェクションと呼ばれます。
• 同様のプロセスであっても、植物細胞、菌細胞、バクテリア細胞の文脈では、多くの場合、形質転換と呼ばれます。ただし、がん生物学の「悪性形質転換」という用語との混乱を避けるため、動物細胞生物学の領域では基本的に形質転換は使われません。
• 形質導入は、ウイルスを用いた細胞への核酸導入を指します。

トランスフェクションには、研究や生物学的製剤製造の分野で幅広いアプリケーションがあります。

研究現場では、幅広い実験や操作の一部に培養細胞トランスフェクションが使われています。例えば、新たに発見された遺伝子を細胞に導入し、そこで発現するタンパク質産物の機能を解明したり、いわゆる遺伝子ノックアウトにより、遺伝子欠損時の細胞挙動を研究したりすることがあります。ほかにも、イメージング装置で観察しやすくするために、哺乳類細胞に緑色蛍光タンパク質（GFP）を導入する際にも用いられます。

トランスフェクションは、遺伝子治療や再生医療でさまざまな役割を担っています。大きな役割の1つが、ウイルスベクターの作製で、in vitroで遺伝子材料を細胞に導入する際によく用いられます。その代表例にCAR-T細胞療法が挙げられます。CAR-T細胞療法では、トランスフェクションで作製したウイルスベクターを使い、患者由来のT細胞をin vitroで遺伝子改変します。その後、このT細胞を患者の体内に戻し、がん細胞を標的にして破壊します。つまり、トランスフェクションは、こうした細胞療法アプリケーションを間接的に支えていることになります。

また、トランスフェクションは、再生医療をはじめとする治療を目的とした細胞治療薬の製造で直接的な役割を担います。例えば、『Journal of Controlled Release』に掲載された論文では、さまざまなトランスフェクション法で幹細胞を遺伝子改変すると、潜在的な治療活性の改善や細胞生存率の向上につながることが指摘されています。

『BMC Molecular and Cell Biology』に掲載された論文は、トランスフェクションを実現する手法として、以下を挙げています。

1. 物理的トランスフェクション

物理的トランスフェクション法は、細胞膜を物理的に破壊することにより、細胞質や細胞核にDNAやRNAを導入します。物理的トランスフェクションの例としては、粒子衝撃法（遺伝子銃法とも）、ダイレクトマイクロインジェクション法（直接注入法）、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、レーザー照射トランスフェクション法などがあります。

物理的手法は、非常に高いトランスフェクション効率を得やすいものの、細胞を損傷するおそれがあり、場合によっては顕著な細胞死を引き起こすこともあります。また、ほとんどの物理的トランスフェクション法は、専用装置が必要で、多くは低スループットです。

2. 化学的トランスフェクション

化学的トランスフェクション法は、内包などによりDNAやRNAを細胞に導入するキャリア分子が欠かせません。このキャリア分子には、カチオン性脂質を使ったキャリア、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマーなどがあります。

化学的トランスフェクション法の中でも、リン酸カルシウムトランスフェクションなどのように、コストが安上がりでも、効率が悪く、細胞破壊のリスクが高い手法もあります。こうした手法は、頑健な非初代細胞株に使用するのが最適です。同じ化学的トランスフェクション法でも、カチオン性脂質キャリアなどのように、高い導入効率や多様な細胞タイプへの適応性のよさで知られるものもありますが、コストが高くなりがちなうえ、複雑な操作を最適化する必要があります。

3. ウイルスを用いた形質導入

ウイルスを用いた遺伝子材料の導入法を形質導入と言い、「生物学的トランスフェクション法」に区分されることもあります。アデノウイルスやアデノ随伴ウイルス（AAV）、レトロウイルスなどの遺伝子改変したウイルスを使って、DNAやRNAを細胞に導入します。通常、こうしたウイルスベクターは、他のトランスフェクション法で作製されます。

ウイルスによる形質導入が好まれている理由としては、遺伝子導入の効率性や安定性に優れている点が挙げられます。技術的に難易度が高いものの、他のトランスフェクション法では扱いにくい細胞でも成功する可能性があります。ただし、ウイルスベクターを使用すると、細胞免疫反応や宿主細胞の変異の可能性、バイオセイフティー上の懸念といったリスクを伴います。

安定トランスフェクションか一過性トランスフェクションか

トランスフェクションで細胞に導入された核酸は、安定的に存在するか、一時的に存在するかの2つのパターンがあります。トランスフェクションには、物理的方法、化学的方法、生物学的方法がありますが、いずれも安定トランスフェクションと一過性トランスフェクションの両方に対応できます。

一過性トランスフェクション：一過性トランスフェクションの場合、導入した核酸物質（プラスミド、オリゴヌクレオチド、mRNAなど）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれず、発現は一時的なものとなります。一過性トランスフェクションはシンプルで実施しやすい反面、その用途は、遺伝子サイレンシング実験や小スケールのタンパク質産生など、短期的な実験に限られます。物理的トランスフェクション法と化学的トランスフェクション法は、一般に一過性トランスフェクションに用いますが、ケースによっては最適化を図ることで安定トランスフェクションに用いることも可能です。

安定トランスフェクション：複製後も、導入した遺伝子材料が保持されるような細胞を発生させる必要があれば、安定トランスフェクションを選択します。この場合、導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれるか、 持続的なエピソームベクターで維持されることになります。安定トランスフェクションが行われた細胞の同定・濃縮を促進するために、多くの場合、対象となる遺伝子材料に抗生物質耐性などの選択マーカーを含ませます。特にDNA導入に物理的方法や化学的方法を使用する場合、安定トランスフェクションは成功までに時間がかかるものです。このような理由から、ウイルスを用いた形質導入などの生物学的方法が好まれます。レンチウイルスや他のレトロウイルスベクターは、遺伝子材料を効率的に宿主ゲノムに組み込み、長期的な発現を確実に維持できるからです。

ここで問題になるのが、トランスフェクション法の選定と、安定トランスフェクションか一過性トランスフェクションかの選定です。この答えを出すためには、使用する細胞株に基づき、この細胞株で成功実績のあるトランスフェクション法を検討します。さらに、対象細胞が初代細胞か、不死化細胞株か、それとも幹細胞かを判断します。細胞の中には、特定のトランスフェクション法に感受性が高いものがあるからです。

また、導入対象の核酸のサイズと形状（大型プラスミド、オリゴヌクレオチド、sRNAなど）を考慮し、この形状に最適な手法を選定します。

トランスフェクション法の選定に当たっては、対象細胞の次工程となる下流のアプリケーションも考慮します。トランスフェクション法によっては、細胞・遺伝子治療薬に使用する細胞などの感受性細胞を破壊する可能性が高くなります。例えば、治療薬アプリケーションには、脂質を使ったトランスフェクションなど、細胞ストレスを最小化する手法が必要になります。将来的にスケールアップが必要なプロセスには、トランスフェクション法の全体的なコストとスケーラビリティが重要な検討事項になります。AAVを利用した遺伝子治療プログラムに取り組む研究者の場合、トランスフェクション法と細胞増殖プラットフォームの選定に当たって、使用する細胞株と、スケールアップに求められる自由度を考慮するといいでしょう。

細胞株と実験操作は1つとして同じものはない以上、どのトランスフェクション法であれ、最適化する必要があります。細胞株の健全性と生存率、核酸濃度、トランスフェクション試薬濃度、細胞のコンフルエンシー、操作時間といった要素すべてがトランスフェクションの成否を左右します。さらに考慮すべき点がいくつかあります。

• 健康な細胞を使い、トランスフェクション試薬の適切な保管を徹底することにより、有効性の低下を招かないようにします。
• トランスフェクション試薬によっては、過剰に使用すると、細胞毒性を生じることがあるため、使用する細胞タイプに応じて、核酸に対する試薬の比率を最適化します。
• 核酸の品質も重要な因子です。通常、遺伝子材料の純度が高いほど、良好なトランスフェクション結果につながります。
• タイミングも重要なポイントです。お使いのプロトコールか試薬パッケージを参照し、正しいインキュベーション時間を確認します。トランスフェクション後は、細胞にストレスがかかっているため、回復しやすいように丁寧なハンドリングを心がけます。トランスフェクション後の培地交換の推奨タイミングについては、試薬メーカーの指示、またはお使いのプロトコールに従います。

検証済みのプロトコールや実績のある試薬を使用すると、成功の確率が高まります。コーニングでは、トランスフェクションを成功に導く検証済みプロトコールを提供しています。試薬メーカーとの協力関係を構築したり、発表済みの研究を参考にしたりすることも、特定の細胞タイプや実験目標に合わせたプロトコール最適化の一助となります。さらに、Corning^® transfectagro™ 低血清培地（日本未発売）などの試薬は、効率的なトランスフェクションをサポートし、Corning BioCoat^® ゼラチンコートプレートはトランスフェクション後の細胞の増殖を促進します。

エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リポフェクション法、ウイルスを用いた遺伝子導入などの手法は人気を集めているものの、課題も残っています。細胞タイプによっては、トランスフェクションが困難なものもあります。例えば、CRISPR/Cas9によるゲノム編集などのアプリケーションには、多くの場合、複雑な遺伝子機構を送達する必要がありますが、細胞への導入は容易ではありません。しかも、細胞治療薬製造の現場では、トランスフェクション効率と細胞生存率の兼ね合いが難しく、研究の遅れやコストの増加を招くことがあります。

このような課題を克服しようと、研究者の間では、研究や細胞・遺伝子治療薬製造のための新たなトランスフェクション手法の開発が進められています。『Scientific Reports』掲載の論文によれば、従来の手法ではトランスフェクションが困難とされる胚性幹細胞（ES細胞）に対して、ある研究チームは、急減圧によって、DNAを保持したプラスミドの導入に成功しました。この新手法は、Pressure-jump-poration（圧力ジャンプポレーション）法と呼ばれ、核酸物質に対する細胞膜の透過性を一時的に高めることができるという点では、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）と同様です。ただし、Pressure-jump-poration法は、エレクトロポレーション法に比べて、初代細胞株で良好な結果を得やすく、DNA損傷のリスクも小さい特徴があります。

『Science Advances』に掲載された別の論文は、熱音響法を使い、間葉系幹細胞の透過処理とトランスフェクションに成功したことを報告しています。この斬新なアプローチでは、音波と熱を組み合わせ、細胞膜の透過性を一時的に高め、細胞毒性を抑えながら大型プラスミドの送達が可能です。この研究チームは、トランスフェクション効率と細胞生存率を維持しつつ、幹細胞への大型プラスミドのトランスフェクション改善を目的に掲げ、同手法を開発しました。

コーニングでは、アカデミアと企業研究室の双方を対象に、細胞培養や先端治療薬に関する最先端のイノベーションを長年にわたって支援しています。お客様のアプリケーションに最適なトランスフェクション法や製品の見極めの際には、当社の専門家がお手伝いします。

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トランスフェクションの成否を左右するのは、細胞株の健全性と生存率、核酸の品質、トランスフェクション試薬、トランスフェクション時間、血清です。細胞は、コンタミネーションがないこと、新鮮培地で培養すること、適切なインキュベーション条件下で保管することが不可欠です。また、トランスフェクションのプロトコールにある血清の要件も確認します。プロトコールによっては無血清条件が求められることもあります。

40〜80％のコンフルエント状態の細胞にトランスフェクションを実施します。細胞が少なすぎると、細胞間の接触が限られるために増殖が乏しくなり、逆に、細胞が多すぎても、外来核酸の取り込みに抵抗性が生じやすくなります。

ほとんどの化学的なトランスフェクション試薬は、試薬の種類にもよりますが、最適な時間の範囲が5分〜30分となっています。この最適時間は、細胞株、トランスフェクション試薬、核酸によって異なります。

いいえ。細胞タイプごとの特性と、各トランスフェクション試薬との相互作用は複雑です。このため、トランスフェクション効率を予測しようとしても徒労に終わります。ただし、ある程度の経験値から言えば、初代細胞や静止状態の細胞、浮遊細胞など、さまざまな細胞タイプでトランスフェクションが難しいことがわかります。

遺伝子材料の純度が高いほど、トランスフェクション結果も常に良好になります。製造工程で細菌が産生するリポ多糖（エンドトキシン）はコンタミネーションの原因となるため、コンタミネーションの同定が極めて重要です。自然免疫系は、痕跡量であっても検出でき、トランスフェクションプロセスを著しく妨げます。遺伝子材料からエンドトキシンを除去する市販キットの使用をお勧めします。

ミニプレップのプロトコールに基づくプラスミド洗浄は、お勧めできません。その理由として次の3点が挙げられます。

• プロモーターには固有の発現率があります。
• 特定の遺伝子特性が細胞生理機能に大きく影響することや、細胞死を引き起こすことがあります。
• 遺伝子材料の大きさと立体構造も、トランスフェクションの成否を左右します。

トランスフェクションは、遺伝子治療や再生医療に不可欠な要素です。プレシジョンメディシン（精密医療）や個別化医療の進展を促進するためには、幹細胞や3D培養による継続的な研究が欠かせません。

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