細胞の凍結保存の心得

1.クライオバイアルには内ねじ式と外ねじ式がありますが、それぞれの長所・短所を教えてください。

2つのタイプは、好みで選んで構いません。バイアル内に何も挿入されないのでコンタミネーションを最小限に抑えられるという理由から、外ねじ式を選ぶ研究者がいます。一方、フリーズボックスへの収まりがいいという理由で内ねじ式を選ぶ研究者もいます。自動化装置を使用している場合、装置のグリッパーに対応するねじ方式かどうか確認する必要があります。

2.フリーザー内の凍結容器として、断熱段ボール箱や発泡スチロール箱は利用できますか。

そのような自作の容器でも使用可能な細胞株は少なくありません。ただし、必ずしも冷却の制御性や再現性、均一性が得られるわけではありません。そのため、融解の際にバイアル間で生存率に大きな差が見られることもあります。したがって、培養細胞に断熱段ボールや発泡スチロールを使うことはあまりお勧めしません。

3.細胞治療用途でジメチルスルホキシド（DMSO）の代替物質についてどのようにお考えですか。

CPAの種類には大きく分けて細胞膜透過性と細胞膜非透過性の2つがあります。細胞膜透過性CPAは、低分子のため細胞膜に浸透できます。この細胞膜透過性CPAとしては、DMSOやグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セルバンカーシリーズなどがあります。一方、細胞膜非透過性CPAは、凍結保護液に添加される高分子です。このグループの例としては、ショ糖、ブドウ糖、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン（PVP）が挙げられます¹。

DMSOは、細胞治療に用いられる幹細胞や樹状細胞を始め、さまざまな細胞タイプの凍結保存に問題なく使用されています。文献^2,3を見ると、多くの著者がウシ胎児血清（FBS）かヒト血清アルブミン（HSA）と、10％ DMSOを含む凍結培地を使っています。

ヒト脂肪組織由来成体幹細胞の凍結保存に用いるDMSOやFBSの代替として、PVPの使用が検討されています⁴。著者は、10％ PVPとヒト血清で凍結保存した細胞を回収したところ、DMSOと動物血清で凍結保存した細胞に類似していることに気づきました。さらに、メチルセルロース単独と、メチルセルロースに低濃度のDMSOを加えたものを使ったところ、アポトーシスアッセイの際、1％ メチルセルロースでも、2％のDMSO濃度と同等の結果が見られました。

1. Cryopreservation and its clinical applications
2. Cryopreserved Mesenchymal Stromal Cells Are Susceptible to T‐Cell Mediated Apoptosis Which Is Partly Rescued by IFNγ Licensing
3. Mature dendritic cell derived from cryopreserved immature dendritic cell shows impaired homing ability and reduced anti-viral therapeutic effects
4. Cryopreservation of Human Stem Cells for Clinical Application: A Review

4.今、融解後のiPS細胞のコロニー形成で苦労しています。コロニーが形成されるまで、どのくらい待てばいいのでしょうか。また、凍結保存プロトコールに問題があると思いますか。

培養細胞の凍結保存は、細胞の栄養補給・管理に伴う手間や費用なしに細胞のバックアップ・貯蔵の確保に広く利用されています。凍結プロセスの成否は、次の4大条件に左右されます。

1. 【良好な細胞状態】iPS細胞は、凍結保存状態から健康な状態に回復するまで、毎日栄養を補給する必要があります。細胞は、2〜4日間継代した後に凍結します。異常増殖があると融解後の生存率が低下しやすくなります。凍結保存前に細胞塊は分離しておきます。CPAは、細胞塊に浸透しにくい場合があり、融解後に生存している細胞がごく一部にとどまることもあります。培養細胞は適切に扱い、丁寧に回収します。iPS細胞を回収する場合には、200〜300 × gで2分間遠心し、ピペッターで丁寧に回収します。凍結保存の典型的な細胞濃度は、1〜2×10⁶ cells/mLです。濃度が高すぎると、細胞生存率が低下しやすくなります。
   
2. 【CPAを適切に使用する】CPAとして最も一般的なのはDMSOです。最終濃度は10％程度が最もよく使われます。iPS細胞を凍結保存する場合、凍結培地にFBSかフィコールを添加する研究者もいます。また、市販品も入手できます。回収効率を高めるには、新鮮な培地や試薬を使うことが大切です。CPAとの混合は実験当日に行います。
   
3. 【凍結速度の制御】理想的な細胞冷却速度は－1℃/分です。プログラムフリーザーを利用すれば、冷却速度を最適に制御できます。コスト管理を重視するのであれば、Corning^® CoolCell^®を利用する手もあります。細胞懸濁液を入れたCorning クライオジェニックバイアルを、室温下でCoolCellにセットし、−80℃のフリーザーかドライアイスロッカーに直立状態で配置します。
   
4. 【適切な凍結保存条件下で保管】液体窒素フリーザーの液面上部空間では、−140℃〜−180℃での気相保存が可能です。気相保存は、バイアルやアンプルのキャップの緩みなどが原因で、取り出しの際に膨張破損するリスクを大幅に抑えられます。
   

iPS細胞融解時の注意事項

1. 37℃に設定したウォーターバスにクライオバイアルを入れて急速に融解します。
   
2. ピペッターで細胞懸濁液を10倍量の培地に1滴ずつ滴下します。作業はゆっくり丁寧に行います。
   
3. 35 mmウェル（6ウェルプレート）ごとの播種密度は、生存細胞数2 × 10⁵〜1 × 10⁶の範囲にします。Corning マトリゲル基底膜マトリックスをコーティングしたプレートだと、融解からおよそ30分経過後に細胞が接着します。播種から24〜48時間後には、70〜80％のコンフルエント状態が観察されます。
   

5.ちょうど今、液体窒素の入手に手間取っています。液体窒素なしにヒトiPS細胞を保存する場合、何かアドバイスをいただけますか。

長期的には液体窒素に直接浸漬しない気相保存で、iPS細胞を凍結保存することをお勧めします。気相温度は、−140℃〜−180℃に達します。哺乳類細胞の保存温度としては−80℃もよく利用されますが、数カ月の保存で生存率が低下する傾向があります。10％ DMSOを含むCPAに10％のフィコール70を加えると、−80℃で凍結した細胞が1年経過後も、液体窒素保存の場合と比較して生存率の低下は見られなかったという研究結果が報告されています。詳細については下記の論文をご参照ください。

1. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at −80 °C

6.私たちの研究室では、肝細胞を凍結保存する培地のDMSO低減に取り組んでいます。このような用途でのDMSO低減について、何パーセントまで低減できるのかを含め、アドバイスをいただけますか。

肝細胞の凍結保存については、マウス、サル、イヌ、ラット、ヒトなど多種多様な肝細胞の報告が上がっています。多くの文献によれば、肝細胞の凍結保存には10〜20％のDMSOが使われています。肝細胞の場合、最小限のCPAとしては、10％のDMSO濃度が最も一般的です。細胞生存率が心配であれば、10％ DMSOを含む凍結培地に補助剤としてオリゴ糖を加えてもいいでしょう¹。著者らの観察によれば、オリゴ糖を加えた結果、TB色素排除法で確認したところ、細胞生存率が最大に改善されたそうです。さらに、スウェーデンの研究チームは、10％ DMSO、グルコース、無水ブドウ糖を含むゼノフリー（異種由来成分不含）の凍結保存液であるSTEM-CELLBANKER^TM（CB）と、標準の12％ DMSO-UW培地を使い、肝細胞の細胞生存率を評価しました²。その結果、肝細胞の場合、DMSO-UW培地よりもCBを使ったプロトコールのほうが、細胞生存率が高くなることが確認されました。

1. Improvement of Hepatocyte Viability After Cryopreservation by Supplementation of Long-Chain Oligosaccharide in the Freezing Medium in Rats and Humans
2. Improved cryopreservation of human hepatocytes using a new xeno free cryoprotectant solution

7.よくある質問だと思うのですが、融解後の細胞生存率を向上させるにはどうすればいいのかアドバイスをいただけますか。うまくいったり、ダメだったりと結果がまちまちで、理由がわかりません。

細胞回収やCPA、保存容器、冷却速度、凍結保存装置、融解など、凍結保存の成否を左右する条件はさまざまです。残念ながら、凍結保存に起因する細胞生存率の問題は、融解・播種手順後に気づくことがほとんどです。そこで、細胞生存率の改善に当たって注意すべき重要チェックポイント4点を挙げておきます。第1は、細胞凍結の際は、細胞の健康状態と細胞濃度が極めて重要だということです。使用する細胞の健康状態が良好なほど、融解後の生存率も高くなります。一般的なCorning クライオジェニックバイアル（コーニングカタログ番号 430661または430489）の場合、細胞数は2 × 10⁶を推奨します。細胞密度が高すぎると、栄養やCPAが不足して細胞の健康状態を維持できない恐れがあります。さらに、凍結前には細胞剥離試薬やCPAへの過剰な曝露を避け、細胞回収の際に室温下に長時間置かないようにします。 第2に、細胞再懸濁液と凍結用培地を入れた凍結保存用バイアルを、−80℃のCorning CoolCellコンテナなどのフリージングコンテナを使用する場合、冷却速度（−1℃/分）が細胞凍結の重要な条件になります。細胞凍結に最適なフリージングコンテナ、CPAのタイプや濃度を使用する必要があります。第3に、凍結保存装置（−196℃）に移す際、細胞を高温に曝露しないようにします。最後に、融解は迅速に行い、毒性や浸透圧ショックを回避するため、CPAを適切に取り除きます。私は先ごろ、動物細胞培養物の凍結保存に関する一般指針をまとめたウェビナーを開催しました。コーニングのウェブサイト²で閲覧できますので、ぜひご覧ください。特に、25分27秒あたりで生存率改善につながるトラブルシューティング方法を解説していますので、ご注目ください。

1. 動物培養細胞の凍結保存ガイド
2. ウェビナー

8.細胞の再凍結方法について伺います。別の研究室から受け取ったリンパ細胞を融解後、後日使用するために試料の一部を再凍結しました。この再凍結した細胞を融解したところ、最初に融解したときよりも細胞生存率がかなり低下していました。こういうものでしょうか。

凍結・融解プロトコール内でCPAを始め、さまざまな条件の最適化に最善を尽くしたとしても、凍結保存は細胞に大きな負担のかかるプロセスです。したがって、凍結・融解プロセス後、ある程度の生存率低下は想定されることで、凍結・融解のサイクルを繰り返すたびに徐々に生存率が低下する可能性があります。一般的に、細胞生存率低下が見られる場合、考慮すべき要因がいくつかあります。具体的には、凍結時は細胞の健康状態と濃度、回収時はCPAや室温への長時間の曝露の回避、冷却速度の適切な制御、凍結保存装置に移す際は高温への曝露の回避、そして迅速な融解とCPAの適切な除去などです。この点については、前出の質問で詳しく説明したとおりです。加えてアドバイスするとすれば、容器内の死細胞集団をチェックするため、凍結前に顕微鏡検査で細胞生存率を調べます。死細胞を除去するには、洗浄手順の際に低速遠心でPBMC（末梢血単核細胞）を分離します。

特にPBMCの場合、凍結保存時間が長くなるほど細胞生存率が徐々に低下する可能性があります¹。さらに、PBMCを採取した被験者個人の疾患が凍結保存に影響を及ぼすこともあります。文献²によれば、デングウイルスに自然感染した小児患者から採取したPBMCをTB色素排除法で調べたところ、健常小児から採取した新鮮なPBMCと比較して、凍結保存後に細胞生存率の低下が見られました。

PBMCのプロトコールをいくつか用意しましたので、ご確認ください。PBMCの遠心分離、DMSOや血清の濃度、凍結保存用培地の温度には特に注意を払っています^3,4。

1. A simple method for the cryopreservation of lymphocytes
2. Viability and Functionality of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells in Pediatric Dengue
3. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation
4. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry

9.COVID-19感染拡大ですぐに研究室が閉鎖されたため、保有するすべての細胞を液体窒素（LN2）で凍結することは不可能でした。iPS細胞は−80℃でどのくらい保存できるでしょうか。

−80℃での保存が細胞に及ぼす影響は、細胞タイプによって異なります。数日から数カ月の保存となると、生存率、特性、遺伝子発現など、融解後の細胞状態に影響が及びます。細胞の多能性を保護するうえで、標準的な10％ DMSOの凍結保存用培地は十分とは言えません。−80℃で3日間保存した場合、生細胞が50％失われ、Oct-4の発現は90％失われます。凍結保存が3カ月続くと、ダメージはさらに大きくなります。とはいえ、融解後に多能性の回復を待ってみる価値はあります。ただし、融解後に14日間培養を続けたとしても、完全な回復に至ることはありません。

なお、研究現場では、−80℃での長期凍結保存を改善させようと、少しでも優れたプロトコールの開発も進められています。凍結保存培地に10％のフィコール70を使うと、−80℃でのiPS細胞の保存でも、LN2による保存と遜色のない生存率、コロニー形成率、多能性表現型を維持しつつ、保存期間を1年に延長できることが報告されています。また、赤血球や末梢造血幹細胞でも改善に成功しています。このトピックについての詳細は、以下の2つの論文が参考になります。

1. Cryopreservation by slow cooling with DMSO diminished production of Oct-4 pluripotency marker in human embryonic stem cells
2. Efficient long-term cryopreservation of pluripotent stem cells at −80 °C

10.組織試料の凍結に適したDMSOフリーのCPAをご存知ですか。

DMSOはCPAとして広く利用されていますが、この化合物には神経毒性や遺伝毒性などの不都合な面もあります。組織凍結の場合、特に下流の臨床応用ではCPAとしてのDMSOの使用は避けたいものです。代替となる化合物の選定は、由来する組織の種類やその後のアプリケーションによって異なります。これまでに細胞膜非透過性CPA（グルコース、ショ糖、ガラクトース、トレハロースなど）や細胞膜透過性CPA（エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ホルムアミド、メタノール、ブタンジオールなど）を始め、DMSOに代わる多くの物質が組織凍結で実証されています。また、市販品もいくつか市場に出回っています。詳細は、以下の参考文献をご覧ください。

1. Successful cryopreservation of whole sheep ovary by using DMSO-free cryoprotectant
2. DMSO-Free Cryopreservation of Human Umbilical Cord Tissue
3. Umbilical cord tissue cryopreservation: a short review

11.複数の研究室から入手したT細胞試料に最適な方法を教えてください。それぞれの凍結プロトコールが不明なのですが、万能な方法はあるでしょうか。

T細胞での成功が報告されている凍結保存プロトコールはいくつかあります。しかし、T細胞の凍結保存に最適なプロトコールであっても、細胞凍結を成功に導く要因は多種多様なため、研究現場独自のテストで修正する必要があります（詳細については質問7と8を参照）。CPAは、多くの著者が5〜10％ DMSOにFBSかHSAを組み合わせており、T細胞に適した冷却速度（−1℃／分以下の速度）を重視しています^1,2,3。 なお、凍結した細胞は、分離したばかりの細胞と比べて、応答性やT細胞機能の低下が見られたほか、凍結時間の延長とともにT細胞の抗原認識の低下が進んだという報告がある⁴点もご注意ください。

1. Cryopreservation of Primary Mammalian Cells
2. The Impact of Varying Cooling and Thawing Rates on the Quality of Cryopreserved Human Peripheral Blood T Cells
3. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization
4. Rapid expansion of T cells: Effects of culture and cryopreservation and importance of short-term cell recovery

12.組織試料の融解後に大量の画像処理を予定している場合、凍結対象の組織試料をどのように調製しておけばいいでしょうか。また、組織試料を画像処理する場合の融解について、アドバイスをお願いします。

組織を凍結するときに忘れてはならない原則がいくつかあります。第1に、組織が形態的に歪むのを回避するため、即座に凍結または固定すること。第2に、新鮮な組織を氷の上に置いたまま、できるだけ早く処理すること。第3に、試料のサイズはなるべく小さくすること。第4に、凍結前に、試料を乾燥させ、液状になりすぎないようにすること。組織試料の融解は、37℃のウォーターバスで迅速に行う必要があります。一部の組織、血管、骨の場合、融解速度を制御すると組織の脆弱性を抑えることができます。これ以外に、対象臓器によってCPAやプロセスは変わってきます。以下の参考文献には、さらに具体的な手法が掲載されています。

1. The cryopreservation of composite tissues

13.−80℃で保存してある細胞を液体窒素タンクに直接移しても問題ありませんか。それとも間に何らかの手順が必要ですか。

一般的には、長期保存が目的であれば、−80℃から−196℃にクライオバイアルを直接移すことができます。