使用ガイドライン

Transwell® (トランズウェル) パーミアブルサポート、Snapwell™ (スナップウェル) およびNetwell™ (ネットウェル) インサート

Transwell® (トランズウェル) パーミアブルサポート

トランズウェルパーミアブルサポートは、足場依存型および非依存型両方の細胞系研究に欠かせない便利で使いやすいツールです。これらのインサートにより単層膜（モノレイヤー）の両側を別々に利用できるため、in vitro での輸送や他の代謝活性を研究するための多目的ツールとなります。

以下にトランズウェルパーミアブルサポートを使用するためのガイドラインを示します。その他の役立つヒントとスキルもご覧ください。

最初に受け皿となるマルチウェルプレートに培地を加え、次にトランズウェルインサートを入れ、最後にインサートのコンパートメント内に培地と細胞を加える方法で使用します。推奨の培地容量を下記の表に示します。
最初の平衡化時間を利用して細胞接着を向上させることができます。培地をマルチウェルプレートに加えてから次にトランズウェルインサートに加えます。次に、細胞培養に使用する温度と同一の温度でプレートを1時間以上、または一晩インキュベートします。その後トランズウェルインサートの新鮮な培地中に細胞を加えてインキュベーターに戻します。
培地の水位を定期的にチェックし、必要に応じて新鮮な培地を加えます。
トランズウェルインサートには、標準のピペットチップ用の穴が3つあり、ここからサンプルを下側のコンパートメントに加える、または取り出すことができます。
標準の細胞学的手法を使用して、トランズウェルインサートを挿入したまま細胞単層膜（モノレイヤー）を固定および染色できます。ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル製のメンブレン材料を溶解する溶媒の使用は避けてください。手順として、適切な試薬を含むマルチウェルプレートの一連のウェルにトランズウェルインサートを順次移します。Transwell®（トランズウェル）インサートを固定および染色するためのプロトコールは、コーニングのオンラインのテクニカルライブラリーで入手できます。
トランズウェルメンブレンから細胞を取り除く必要がある場合、トランズウェルインサートとプレートウェルの両方を洗浄することを推奨します。次に、剥離液をウェルとトランズウェルインサートの両方に添加し、細胞が剥離し始めるまでインキュベートする必要があります。トランズウェルインサートから細胞を剥離する手順のプロトコールとして、「Corning® Transwell®（トランズウェル）インサートのトリプシン処理手順」がコーニングライフサイエンスのウェブサイトの技術欄から入手できます。
固定および染色した接着細胞の付いたポリカーボネート製またはポリエステル製メンブレンは、メスでメンブレンの辺縁部を慎重に切り取ることで、トランズウェルインサートから取り外せます。
コラーゲンコートPTFEメンブレンは破れやすいため、取り外す際の取り扱いに注意を要します。濡れたセルロース系メンブレンフィルターは、メスで切り取る前に、トランズウェルインサートの底面と直接接触させる必要があります。濡れて、さらに硬くなったセルロース系フィルターはコラーゲンコートメンブレンのサポートとして用いることができます。

Transwell (トランズウェル) パーミアブルサポートの推奨培地容量

トランズウェルインサート直径	インサートメンブレン培養面積	マルチプルウェルプレートまたはディッシュのタイプ	プレートウェル当たりの添加量	トランズウェルインサート内への添加量
4.26 mm	0.143 cm²	96-ウェル	0.235 mL	0.075 mL
6.5 mm	0.33 cm²	24-ウェル	0.6 mL	0.1 mL
12 mm	1.12 cm²	12-ウェル	1.5 mL	0.5 mL
24 mm	4.67 cm²	6-ウェル	2.6 mL	1.5 mL
75 mm	44 cm²	100 mm ディッシュ	13 mL	9.0 mL

役立つヒント

パーミアブルサポート上での細胞形態と細胞密度は、フィルターのポアサイズに影響されます。
ポアサイズが大きくなると、パーミアブルサポートの孔を通ってある種の細胞が遊走します。
パーミアブルサポート上での細胞増殖は、良好な細胞接着に関係する最初の播種密度に影響されます。最適な増殖を得るため、最初の使用時にさまざまな播種密度での播種をお試しください。
細胞接着と拡散は、播種前にパーミアブルサポートを培地中にプレインキュベートすることで改善される可能性があります。
通常のプラスチックディッシュ、フラスコを用いた培養で、細胞外マトリックスコーティングが必要な細胞では、パーミアブルサポートでもそれらのコーティングが必要となります。
Transwell-Clear（トランズウェルクリアー）インサートには透明な組織培養処理ポリエステルメンブレンが含まれ、位相差顕微鏡を使用することで細胞を簡単に観察できます。
Transwell-COL（トランズウェル‐コル）インサートには、I型およびIII型ウシ胎盤コラーゲンの等モル混合物で処理したPTFEメンブレンが含まれます。そのためフィルターメンブレンの線維をコーティングする生物学的に安定したコラーゲンマトリックスになります。これらのトランズウェルインサートは、生物学的コーティングを必要とする細胞培養に最適です。

製品情報: Transwell (トランズウェル) パーミアブルサポート

メンブレンタイプ

トランズウェルパーミアブルサポートでは、ポリカーボネート、ポリエステル (PET)、コラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン (PTFE) の3種類のメンブレン素材があります。ポリカーボネートトランズウェルインサートは薄い半透明のメンブレンを特徴とし、0.4 μm～8.0 μmの4種類のポアサイズがあります。大半のメンブレンには細胞接着を最適にするための処理を施しています。滅菌済みで、プレートやディッシュに取り付けられた状態で提供しています。ポリカーボネートメンブレンは、大半の有機固定液と染色液に耐性があります。ポリエステル (PET) 製のトランズウェルクリアーのインサートには、顕微鏡で透過観察でき、細胞接着と増殖を最適化した組織培養処理済みのポリエステルメンブレンが付いています。トランズウェルクリアーでは、位相差顕微鏡下で細胞を良好に観察できるため、細胞生存率と単層 (モノレイヤー) 形成の評価が可能です。Transwell-COLインサートは、コラーゲン処理した (湿潤時) 透明なPTFEメンブレンを備えているため、細胞の接着および分散が促進されるだけでなく、培養中の細胞を観察できます。Transwell-COLメンブレンは、ウシ胎盤由来のI型およびIII型コラーゲンの等モル混合物でコーティングしています。遮蔽フィルム層となる従来のコーティング法とは異なり、コーニングのコーティング加工は、生物学的に安定したコラーゲンとなるようにフィルターマトリックスの各線維をコーティングしているため、メンブレンの多孔性が維持されます。

特性	ポリエステル（PET）	ポリカーボネート	PTFE／コラーゲンコート
光学特性	透明	半透明	湿潤時に透明
細胞の可視性	良好	不良	細胞の外観
組織培養処理	あり	あり	なし
メンブレン厚公称値	10 µm	10 µm	30 µm
マトリックス／ECMコーティングとの互換性	あり	あり	あり
コラーゲン処理	なし	なし	あり
ポアサイズ（µm）	0.4、1.0、3.0、8.0	0.4、3.0、5.0、8.0	0.4、3.0

インサート培養面積*

*数値は公称値として示すものであり、弊社の製造工程で起こり得るわずかな変動によって変化する可能性があります。確実に実験を成功させるためには、弊社の示す値とは関係なく、お客様ご自身の方法で検証することをお勧めします。

トランズウェルインサート直径	マルチプルウェルプレートまたはディッシュのタイプ	インサートメンブレン培養面積
3.2 mm	24 ウェル	0.08 cm²
6.5 mm	24 ウェル	0.33 cm²
12 mm	12 ウェル	1.12 cm²
24 mm	6 ウェル	4.67 cm²
75 mm	100 mm ディッシュ	44 cm²

ポアサイズ

実験に合った適切なポアサイズを選択することも非常に重要です。小さなポア（孔）サイズのトランズウェルメンブレン（0.4 μmまたは3.0 μm）は、主に薬物輸送研究で使用されます。細胞の浸潤、遊走、運動性の研究では通常、3.0 μm以上の大きなポアサイズのトランズウェルメンブレンを使用します。メンブレンの孔を通って遊走する細胞の能力は使用する細胞株、培養条件、ポアサイズに依存します。ポアサイズが3.0 μmより小さい場合、細胞遊走は起こりません。重要な実験には、適切な対照とさまざまなポアサイズを使用して、細胞培養に最適なサイズを検討することをお勧めします。

ポア密度

ポリカーボネート（PC）とポリエステル（PET）製のトラックエッチドメンブレンは、以下に記載する公称値でポア密度を規定しています。PTFEメンブレンは屈曲路を形成する伸展性のメンブレンであるため、規定のポア密度はありません。

ポアサイズ(µm)	ポリカーボネートメンブレン（ポア／cm²)	ポリエステルメンブレン（ポア／cm²)
0.4	1 x 10⁸	4 x 10⁶
1.0	-	1.6 x 10⁶
3.0	2 x 10⁶	2 x 10⁶
5.0	4 x 10⁵	-
8.0	1 x 10⁵	1 x 10⁵

化学薬品適合性

すべてのトランズウェルメンブレンは、メタノールやホルムアルデヒドなどの組織固定液に耐性があります。ポリエステル製トランズウェルメンブレンの耐化学薬品性は総合的に優れています。これらのメンブレン（ポリスチレンハウジングを除く）は、多くのアルコール、アミン、エステル、エーテル、ケトン、油、および多くのハロゲン化炭化水素やDMSOなどの溶媒に対応しますが、強酸、強塩基と共に使用することは推奨しません。