What are Extracellular Vesicles? | Therapeutic Potential of Extracellular Vesicles | Corning

以下は、2022年1月24日にCell & Gene Therapy Insightsに掲載された記事を翻訳したものです。

Q: この治療様式は現在、確かに力強い成長を見せています。この動きを後押しする具体的なアプリケーションはありますか。また、これまでのデータからどのようなことが言えるでしょうか。

Pei-Chen Chiang(以下PC)：Amyからも説明があったように、幹細胞由来のEVからの再生は、おそらく移植拒絶反応を阻止できる一方、幹細胞自体と同様に増殖促進能は維持されます。

現在、多血小板血漿(PRP)療法と呼ばれる治療法が普及しています。これは患者自身から抽出した血小板が高濃度に含まれる血漿を注射することにより、損傷した腱や靱帯、筋肉、関節の治癒を促進します。このように、PRPは、各患者自身の治癒システムを生かして筋骨格の問題を改善します。現時点の研究結果からは、この治癒をもたらしているのが、EV濃縮血漿であると考えられています。

COVID-19や慢性感染症などの疾患の治療効果に関しては、幹細胞由来EVの研究の結果、炎症の軽減にはステロイドより高い効果を発揮することがわかっています。幹細胞由来EVの免疫調節能は、私たちの想像を超える効果を持つ可能性があります。再生医療と感染症という2つの注目領域は、非常に重要な推進力になると考えています。

これまでのところ、EVを直接応用した治験はわずか数件にとどまっていますが、現在の初期相試験では有望視されています。特にCOVID-19の治療の場合、現時点の治験状況を見ると、非常に有望な結果が10件以上はあると考えられます。しかしEVには不均一性があるため、有効性の評価が複雑化する点には注意しておく必要があります。

Q: さまざまなアプリケーション領域で研究にEVを使用する場合、重要なベストプラクティスは何だと思いますか。

Linda Hsu(以下LH)：研究室環境での臨床への橋渡しは、EVの産生から単離、同定、操作までのワークフローがあります。EVの産生では、宿主細胞の選定と培養条件が極めて重要です。親細胞は、EVの活性や組織ホーミング特性に加え、免疫遺伝や発がん性も考慮して選定する必要があります。

お薦めの培養方法としては、多段型培養フラスコやバイオリアクターなどがあります。この段階での主目的は、親細胞が良質なEVを効率的に産生するのに最適な環境を整えることです。良質なEVという意味で言うと、AmyやPei-Chenも触れていたように、EV集団には多様な小集団が含まれており、サイズも生態も構成成分も、形成機構さえも異なる可能性があります。

そこでEVの同一性や純度の判断基準が必要になります。2014年、国際細胞外小胞学会(ISEV)は、EV研究の際に評価すべき最も基本的な特性を検討し、例えばエクソソームのサイズは直径30〜150 nm、マイクロベシクルは100〜1,000 nmと定めました。

さらに、EVの形態も脂質二重層構造を示し、試料のEV含有を示すものとしてISEVが定義するCD9、CD81、CD63、TSG101など一団の一般的なマーカーを発現する必要があります。

EV単離に関しては、通常、細胞培地からEVを分離します。単離・精製プロセス全体では、少なくとも2、3のステップがあります。現在、超遠心法でEVを単離し、粒子サイズに応じた分画遠心法で精製する方法は、特異的試薬が不要なため、最も広く用いられています。ただし、標的動物ごとのEV投与量が小胞数で100万〜100億個であることを考えると、組織再生に十分な量のEVを得るのに膨大な時間がかかる点は最大の欠点と言えます。

最近ではいくつかの研究から、限外濾過とサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせがEVの高収率化と高純度化につながることがわかっています。必要とするEVの特性や純度に応じて、単離と精製の双方で既存の手法を組み合わせ、最適化する必要があります。

臨床実装の下流工程には、標的細胞へのEV移行方法を評価する薬物負荷試験・薬物動態試験、最適な臨床用量や反復投与毒性の有無を判定する安全プロファイルがあります。

従来の遺伝子工学やEV研究に利用可能な細胞療法領域を基に、すでに確立された方法やコンセプトがいくつもありますが、さらに発展させるためには、もっと総合的な評価が求められます。

Samantha Haller(以下SH)：改めて強調しておきたいのですが、Lindaが言うようにEVには不均一性があるため、EVの品質は細胞品質に大きく依存します。

一定の品質を保ち、ロット間変動を回避するためには、一定の標準化された細胞培養法が必要です。つまり、培養環境である培地の組成を明確に規定し、常に同一になるようにしなければなりません。

Q: 以前、間葉系幹細胞(MSC)を扱っていた研究者の多くがEVに軸足を移しつつあります。このようにEVに参入する際に考慮しておきたい重要事項や課題にはどのようなものがありますか。

SH：MSCは、最も入手しやすい分化多能性幹細胞であり、さまざまな組織から入手できます。MSCは現在、主に幹細胞治療の治験に使われています。

いくつかの治験で非常に有望な結果を出しており、一例として創傷治癒で顕著な成果をあげています。しかし、こうした治療法の主な治療効果は幹細胞自体に起因するものではなく、こういったMSCからの分泌物、つまりEVやエクソソームによるものであることを示す研究もあります。

こうしたEVは、親細胞と比較して、さまざまなモデルで同等か、それ以上の治療能を持っています。これまで見てきたように、EVは幹細胞よりも優位性があります。非免疫原性であり、血液脳関門を迂回する能力もあります。また、指向性も考慮しておきたいポイントです。EVは指向性が親細胞に依存していて、また操作可能なため、行き先を方向付けしやすいのです。

有望な手法は多数ありますが、同時に考慮すべき点もあります。現在、EVに見られる治療効果の多くに関して、作用機序は完全には解明されていません。例えば、FDA医薬品承認取得を迅速化するためには、作用機序の理解を深める研究がさらに必要になることは間違いありません。

もう1つのポイントはEV産生です。多くの人々がこうした治療法を利用できるようになるためには、大規模産生法が必要であり、しかも治療用に最適化されなければなりません。EVには不均一性があり、EVの品質は細胞の品質、培地の品質、細胞培養の条件に依存します。このすべてが最適化され標準化されなければ、ロット間変動は抑えられません。

このような変動はEVの積荷に影響を及ぼす可能性があるため、幹細胞の特性評価だけでなく、EVの完全な特性評価も必要です。ここで注意しておきたいのは、これまでのところ規制当局がエクソソームに関してガイドラインを策定していない点です。また、EVの解析方法についても、妥当性を確認する必要があります。さらに、大規模なEV単離の必要があるため、EVの単離も重要なポイントになります。

望みはあります。すでにEV特異的にEV単離の精度を高める新しい戦略が生まれているからです。また、こうした新戦略をスケールアップすることも重要です。

規制の面について改めて触れておくと、これは新しいタイプの生物学的療法です。今のところ、FDAにしても欧州医薬品庁(EMA)にしても、EVの特性評価や解析法について具体的なガイドラインを策定していません。EVの特性評価方法に関してまだバリデーションが必要ですが、現行の方法で治療法承認に十分に対応可能である点を規制当局に働きかけていかなければなりません。

Q: ここからは実現技術や、EV産生・アプリケーションの発展を後押しするにはどうすればいいのかといった点をうかがいます。最近の大きなイノベーションにはどのようなものがありますか。また、どういったツール類が必要になってくるのでしょうか。

AK：EVの同定はすでに数十年の歴史がありますが、技術的に大きなブームになったのは、2010年代初めになってからのことです。治療法としてのEVは、2016年にかなりの数の論文に登場し始めました。多くの技術的な進歩が見られますが、そのほとんどは前臨床段階か学術研究段階にあります。

商用化を果たした技術もわずかながらありますが、通常、こうした主要イノベーションは、前臨床環境の研究室のベンチで少しずつ段階的に進められているものが大半を占めます。

このようなイノベーションは大きく分けて3つの分野で見られます。第1は、特殊な培地や血清です。第2は、Samanthaが挙げていたように、現在使われている単離・分離の技術や装置です。第3は、EVの生体分子含有量と物理特性の両面からの特性評価です。

各分野の主要イノベーションを3つ挙げるとすれば、第1はEV除去血清です。コーニングの研究チームとしての取り組みの中でわかったのですが、FBSはEVの研究に使いにくいのです。その主な理由として、FBS自体にウシ由来のEVが含まれる点が挙げられます。

研究現場では、使用する試薬由来のEVを最終産物のEVの10%以下にとどめたいと考えていますが、必ずしも簡単なことではありません。一部のMSCは、先ほど述べたように、他のタイプほど生産性は高くないこともあり、どれがノイズで、どれが細胞のもたらす本当の治療結果なのか判断が難しいのです。さまざまな企業が、多様な技術を生かしてEVを除去した独自の血清づくりに着手しています。

第2の主要イノベーションは、ナノ粒子トラッキング解析です。この技術のおかげで、EVをリアルタイムに観察できるようになりました。ご想像のとおり、ナノサイズで非常に脆弱な生物製剤を静止画像で可視化することはとても難しく、かといって低温顕微鏡法か他の蛍光法でそれだけの解像度を確保することも困難です。

マイクロ流体デバイスと適切な顕微鏡を組み合わせてEVをリアルタイムに観察し、サイズや濃度の特性評価ができれば、大きな効果があります。すでに述べたように、どの手法が普及して標準になるのか簡単には見極められませんが、サイズや濃度の把握という意味では、ナノ粒子トラッキング解析がゴールドスタンダードになりつつあるようです。

第3の主要イノベーションは、バイオプロセス容器をEV産生用に適用する方法です。先ほど触れたように、この技術の大部分は前臨床段階で同定され、開始されています。それは、小型Tフラスコ、ウェルプレート、EV産生用の少量の組織や細胞レベルでの話でした。最近の動きとしては、EVが生み出す治療法の臨床的な価値が認められ始めています。

臨床用量の産生に向けてスケールアップするためには、大型容器を使用する必要があります。想定されるのは、Corning® CellCube® 灌流培養システム(日本未発売)、Corning CellSTACK® 培養チャンバー、さらにはCorning HYPERStack® 容器も含め、小設置面積で大量の細胞培養が可能な製品です。こうした容器をEV産生に使えるようになれば、非常に大きな進歩となり、EVの臨床応用が考えられるようになります。

優れたイノベーションは多数ありますが、足りないものはまだあります。最初に挙げたいのは、Samanthaがすでに核心を突いていましたが、現場での基準や手順の受け入れ状況です。各種論文があるほか、特に2018年にはISEVが、こうした手法や命名法を始め、この領域のあらゆるものを定義するためにコンソーシアムを立ち上げ、結束力向上や議論の土台の共通化をめざしました。しかし、依然としてその域には達していません。ゴールドスタンダードの手法を見極められるまでには至っていませんし、特性評価に必須の条件も確定していません。この領域には、どういう手法があり、どういう結果が得られて、ベンチから臨床までEVをどのように生かしていけるのか。私たちが解決しなければならないことはまだたくさん残っています。

本当の意味でスケール変更可能な単離、分離、濃縮の手法や装置も必要です。市場を見渡すと、こうした装置は液体1 mL未満を扱えるものから、最大だと私が知る限りでは500 mLくらいまで多岐に渡ります。Corning HYPERStack セルカルチャー容器の場合、EV産生用に12段容器で1 L以上の液体が入るのですが、これだけの量の分離を処理できる優れた標準の装置や手法はありません。この点は、臨床用量へのトランスレーションに当たって必ず検討しなければなりません。これだけの液体をタイムリーに処理し、EVの完全性も確保する必要があります。

最後に、これも新たな領域なので論文に毎日のように新しい話題が登場します。2D細胞培養から、人体内の状況の再現性が高い3Dモデルへの移行など、細胞培養自体の領域でも依然として新たな発見が多くあります。そのような知見が増え始め、スフェロイドやオルガノイド、その他の組織工学アプリケーションが視野に入ってくる中、2D環境から脱却し、3D細胞培養モデルでのEV産生に切り替えた場合の効果を考えたEV領域の対応も始まっています。

最良のEV出力を得るための最適な細胞培養条件、言い換えれば灌流か静置か動的かの細胞培養方法を同定するうえで、理解しておかなければならないことはたくさんあります。これは量の面だけでなく、質の面も同様です。

往々にして細胞培養では、EV産生量の増加につながるストレスや環境要因が持ち込まれています。それに伴って品質にはどういう影響があるのでしょうか。冒頭に出した例えで言えば、EV内に含まれるショートメッセージへの影響です。細胞を力学的流体運動の影響下に置くと、その内容はどう変わるのでしょうか。

この情報に光を当て始めた論文もありますが、このタイプの培養をサポートするために、プロトコールのほかバイオリアクターや容器をどうすれば最適化できるのか、理解をさらに進めるために深堀りする必要があります。これは少々聞き慣れない話題です。細胞培養ではほとんどの場合、通常、細胞が最終産物になることから、細胞に重点が置かれます。しかし今回の場合、EVを含有する液体環境として、使用済み培地に焦点を当てることになります。

これは、その廃物を取り出して最適化し、最良のEV治療効果をもたらすために完璧な条件を見極めるという意味では、逆方向から考える必要があります。

Q: この領域をさらに発展させるうえで、どのような期待を抱いていますか。また、現行のアプリケーションや将来登場しそうなアプリケーションの中で、今後注目を浴びるのはどれでしょうか。

PC：アプリケーションに関しては、特に治療上のニーズの面で、依然として幹細胞由来EVを使った再生医療が長期的に最大のニーズになると考えています。感染症治療向けの免疫調節は、COVID-19でニーズが非常に高まっているため、すぐに市場に受け入れられる見込みです。

ほかにも興味深い市場を挙げるとすれば、がん治療を支援する腫瘍抗原由来EVが注目の領域で、すでに治験も進められています。mRNAのような実用的アプリケーションにはほど遠いものの、需要がある限り、すぐに市場に受け入れられる可能性があります。腫瘍抗原由来EVは、がん治療の検査用としてたちまち受け入れられる可能性があると思います。

現在、薬剤の積荷に改変EVを使用したケースがわずかながらあり、リポソームや脂質ナノ粒子よりも臓器指向性の高い送達効果を発揮しています。例えば、mRNAは表面に送達する際に脂質ナノ粒子が必要ですが、積荷にEVを使用できれば、循環系全体に行き渡るよりも、はるかに特異的に当該臓器を標的にできることになります。

人気のEVアプリケーションの次の波を支えるのは、今挙げた2つの領域になると思います。現在、アプリケーションのほとんどに体内にある幹細胞が直接使われています。これは、理解も制御もはるかに簡単になるからです。すでに話題に上がったとおり、大規模培養方法や精製方法、単離方法など、今後数々のハードルが控えています。EVの特性評価の方法でさえ、依然として大きな課題となっています。

今後、市場全体、世界全体にどのようなEVのアプリケーションが登場するのか楽しみです。非常に興味深い領域になるでしょうし、今後の展開に期待しています。

SH：Pei-Chenの言うとおりだと思います。私の視点では、EV領域は幹細胞から産生されたEVをそのまま使うことも、その後、さらに操作することもできます。EVをそのまま利用するケースは再生医療領域で多く見られます。これは非常に大きな領域です。幹細胞異常に関するあらゆる疾患が対象となります。非常に幅広い疾患が含まれます。高齢疾患・加齢性疾患や、熱傷など創傷治癒にも関わってきます。この領域だけでもかなりの規模があります。

一方、EVの操作について考えると、EV産生の後、指向性を変えるためにEVを外部から操作します。こうすることで、対象組織にEVを方向付けることができます。また、積荷も改変して治療薬やmRNA（COVID-19ワクチンなど）を加えたり、遺伝子発現に影響する要素を加えたりすることも可能です。こうすることで治癒やより良い予後につながる疾患は、潜在的にかなりの数に上ります。

EVへの期待は大きく、さまざまな可能性があります。

AK：先ほどSamanthaが触れていたEVの編集・操作とも関連しますが、親細胞の遺伝子操作でEVへの治療用分子の導入を増加させる方法も考えられます。

これは、細胞という天然のエンジンの力を生かして、天然の治療法を生み出す発想にほかなりません。その発展形がワクチンであったり、低分子生物製剤であったりします。繰り返しになりますが、私たちは、このように細胞をいわば生産施設に見立てて、送達可能な天然の小さなパッケージを生み出しています。希少疾患や血液疾患などに対する細胞・遺伝子治療でこうした動きが多く見られます。

COVID-19やワクチン製造の代替策についても考えられます。しかも、合成のデリバリー担体を必要としない可能性があります。臨床環境でEVが可能性を発揮する転換期を迎えていると思われます。私としては、過去5年間のEVを取り巻く出来事を思い起こすと、これからの5年間のEVの行方がとても気になります。