コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法 | Corning

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コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

 

推奨コーティング方法

ゲル化法:

Corning® コラーゲン I(ラット尾)は、カバースリップや培養容器上でゲル化、あるいは細胞接着のための薄層コーティングとして使用できます。ゲル上、ゲルの中、あるいはゲル層の間などで細胞を培養することができます。

薄層コーティング法:

コラーゲン I(ラット尾)は5 µg/cm2の薄層コーティングで使用することをお奨めします。アプリケーションに最適なコーティング条件を決めるためのガイドラインとしてご使用ください。

1.        0.02 N 酢酸を用いて50 µg/mL に希釈してください。コラーゲン I(ラット尾)は中性では溶解しません。

2.        5 µg/cm2になるように、十分量のコーティング溶液を添加してディッシュをコーティングしてください。

           例)35 mm ディッシュの表面積は約10 cm2なので、上記の溶液1~2 mL で十分にディッシュをコーティングすることができます。

3.        常温で1 時間インキュベートします。

4.        残った溶液を慎重に吸引してください。

5.        酸を除くために、PBS または無血清培地で穏やかにリンスします。

6.        プレートはすぐに使用することもできますし、または風乾も可能です。2~8℃の滅菌状態で1週間までなら保管することができます。

ゲル化法 1:

コラーゲン I(ラット尾)は、下記の手順でpH がアルカリ性に傾いたときにゲル化します。

1.      アンモニアを気化させる容器として、150 mm ディッシュのフタの内側に約5 cm の滅菌済みガーゼスポンジを貼り付けたものを用意します。ガーゼに水酸化アンモニウムを十分染み込ませます。150 mm ディッシュにふたを戻し、わきに置いておきます。

2.      コーティングしたい表面にコラーゲン I(ラット尾)を均一にコートしてください。必要に応じてコーティングの厚みは変えることができます。22 mmのカバースリップをコーティングするにはコラーゲン I(ラット尾)50~100 µL で十分です。100 mm ディッシュにはディッシュ当たり約6.0 mL、60 mm ディッシュには約2.3 mL、35 mm ディッシュには約1.0 mLを加えてください。

3.      コーティングしたカバースリップやディッシュはふたをしないで1の容器にいれ、3分さらします。

4.      コーティングしたカバースリップやディッシュを30分間、滅菌蒸留水に浸します(35 mm ディッシュには5 mL、60 mm ディッシュには10 mLの滅菌蒸留水が目安です)。この蒸留水を吸引し、新たな0.5~1.0 mL の滅菌蒸留水を浸して、クリーンベンチ内に一晩静置します。

5.      滅菌蒸留水を吸引し、血清を添加した平衡塩類溶液に交換して2~8℃で保管します。

ゲル化方法 2:

1.      下記を氷上に置きます。

1.1.         Corning コラーゲン I(ラット尾)

1.2.         滅菌済み10X リン酸緩衝食塩水(10X PBS)

1.3.         滅菌蒸留水(1N NaOH)

1.4.         滅菌 1N 水酸化ナトリウム

2.      使用するコラーゲン I(ラット尾)溶液の最終容量と最終コラーゲン濃度を決めます。

3.      コラーゲン I(ラット尾)の最終容量が入る、十分な容量の滅菌済みのチューブを氷上に置きます。

4.      クラス 100 フード内で下記のステップを滅菌操作で行います。

4.1.         下記の容量の10X PBS をチューブに入れます。

                画像

4.2.       使用するコラーゲン I(ラット尾)の量を計算します。(4.6 までチューブには入れません)

              画像

4.3.         10X PBS に下記の量の氷冷滅菌1N NaOHを加えます。

               (加えるべきコラーゲンの量) x  0.023 mL  = 1N NaOH

4.4.         10X PBS に下記の量の氷冷滅菌1N 水酸化ナトリウムを加えます。

               (最終用量)  -(コラーゲン量)-(10X PBSの量)-(1N NaOH)= 加えるべき滅菌水の量

4.5.         チューブの中身を混ぜ、氷上に置いておきます。

4.6.         計算したコラーゲン I(ラット尾)を加えて混ぜます。使用するまで氷上に置いておきます。

               コラーゲン I(ラット尾)溶液はすぐに使用することもできますし、氷上で2~3時間であればおいておくこともできます。

5.      コラーゲン I(ラット尾)溶液はすぐに使用することもできますし、氷上で2~3時間であればおいておくこともできます。

6.      使用する準備ができたら、準備した溶液を無菌的に細胞培養容器に移し、37℃で30分間ゲル化させます。