下文最初发表于2020年6月15日的Cell Culture Dish上，点击此处可查看。
我们刚刚结束了主题为如何最大程度地降低污染风险并保护细胞培养物的咨询专家会议。实验室和细胞培养污染是研究实验室、工艺开发实验室以及生物生产过程中面临的重大风险。污染会影响细胞培养和实验结果，导致实验不准确，从而浪费宝贵的实验资源。生物制造领域也非常关注这一问题，因为它是导致批次不合格的主要原因之一。
不幸的是，污染问题非常常见。造成污染的原因有多种，如人为因素、已感染培养物的交叉污染、不恰当的实验室方法以及污染的原材料等。此外，污染有时很难检测出来，这意味着在发现问题之前，污染可能已经扩散至大量培养物。
污染几乎无处不在，因此要保护宝贵的培养物是一个非常艰巨的任务。不过您无需担心，我们可随时为您提供帮助！在本次的咨询专家会议，我们的专家团队将为您解答有关污染以及如何最大程度降低风险的问题。专家们探讨了如何发现和消除污染源，包括原材料检测和过程检测策略，此外还介绍了细胞培养污染预防及拯救方法以及抗生素的使用。
Elisabetta Difilippo博士是康宁生命科学EMEA地区的技术服务专员，主要负责解答有关康宁生命科学产品和相关应用的问题以及进行技术培训。她毕业于药物化学与技术专业，拥有食品化学博士学位，目前已在康宁工作了4年。
Eva Nokes博士是康宁生命科学北美区技术服务团队的主管。她拥有布兰迪斯大学的分子与细胞生物学博士学位，主要负责为康宁生命科学产品提供支持，包括产品选择、应用支持和疑难解答。她目前已在康宁工作了5年。
如何发现支原体污染？
支原体污染确实是细胞培养项目中的关键评估因素，因为它会影响细胞的行为、形态和功能。此外，期刊论文评审可能会要求提供支原体检测结果 (例如：报告所用标准、数据可用性、材料、行为规范以及实验方案)。幸运的是，采用简单的DNA荧光染色法和基于PCR的支原体检测方法均可对其进行检测。您既可在实验室轻松完成上述检测，也可将样本送至外部实验室进行检测。
我们的团队始终使用无菌技术和新鲜培养基，但仍会发生细菌污染，出现培养基浑浊和pH值下降，请问这是为什么？
通风橱和培养箱通常是多人/多个研究团队共用，很容易成为污染源，因此必须定期对其进行维护和清洁。培养箱应使用消毒剂和70%乙醇每月清洁一次，架子应进行高压蒸汽灭菌。水盘应经常清洁 (高压蒸汽灭菌，蒸馏水) 并及时擦拭溅溢物。建议每天用70%乙醇清洁通风橱内空间，每月用10%漂白剂或等效产品清洁一次。
我们的实验室使用MSC进行研究，并有固定的培养基供应商。我们已通过内部会议分享了有关原材料和培养基污染的信息。请问我们是否有必要对进入实验室的培养基或其它原材料进行额外检测？若有必要，应当进行哪些检测？
细胞系和原材料供应商应在产品放行前进行广泛的检测，提供列出已完成检测的文件，并注明无菌水平。需要注意的是，无菌保证水平 (SAL) 可能因生产商或产品的不同而异。SAL是指灭菌后单位产品表面上残存微生物污染的概率，用10-n表示。例如：SAL 10-3表示1,000件产品中可能存在微生物污染的机率为1。若细胞和/或分析产品极其敏感，可以选择在使用前先过滤灭菌培养基。无需进行进一步检测。不过，有些实验室可能需要遵循更严格的指导原则，应针对这些要求调整检测。我们建议您联系生产商，获取更多相关产品检测信息或说明。注：若对某种培养基或试剂存有疑虑，最好将具体问题告知生产商，由他们开展相关质量调查。
我们想对培养物进行无菌检测，但没有找到简单易行的方法。请问是否有快速的无菌检测方法，就像内毒素检测那样？
无菌检测一般需要较长的孵育时间 (14天) 来确定污染物的生长情况。市场上有一些更快速的检测，可以在更短的时间内提供结果，有时只需3天。不过，我们未对这些方法进行内部检验，因此无法就其有效性或性能提供任何建议。您需要根据具体需求设置检测程序。下方提供了一篇2015年综述的链接，文中比较了几种不同的方法并给出各自的注意事项。
培养箱中能否不放水盘，在非潮湿环境下 (潮湿易滋生微生物) 进行细胞培养？在离心以及将细胞加入冻存管冻存时，能否省去转移步骤？能否直接在最初的细胞培养容器中进行离心和冻存？
本次论坛的主题是细胞污染，上述问题已超出讨论范围，不过我们仍然很乐意为您解答。这些具体的技术问题更适合由康宁专员来回答，他们会为您找到基于流程的定制解决方案。请联系以下技术服务团队，我们会有一名代理为您提供帮助或帮您联系现场应用专员。美洲地区：Scientificsupport@corning.com，亚太区 (包括大中华区、东南亚、韩国、印度、澳大利亚和新西兰)：ScientificSupportAP@corning.com，EMEA地区 (包括欧洲、中东和非洲)：ScientificSupportEMEA@corning.com，日本：ScientificSupportJP@corning.com
我们的实验室已经不再使用抗生素，但最近发生污染后，新任实验室主管建议我们在一些长期培养物中使用抗生素，请问这是否可行？
抗生素广泛用于防止体外培养出现细菌污染，但已有研究表明抗生素会诱导细胞基因表达和调控变异。因此，必须了解、检测并评估抗生素对特定细胞培养物的作用。如果您正在从事化合物检测，也需要对抗生素的使用进行评估，因为药物与抗生素可能会以某种未知方式相互作用。
利用转录组测序 (RNA-Seq) 和染色质免疫沉淀测序 (ChIP-Seq) 等技术可以初步检测并评估抗生素对细胞基因表达的作用。因此，我们建议根据具体情况对短期和长期细胞培养中的抗生素使用进行评估。下面的参考文献可在这方面提供一些指导：
Ryu, A.H., Eckalbar, W.L., Kreimer, A. et al. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep 7, 7533 (2017).
除遵循实验室操作规程外，还有哪些可防止污染的措施？虽然我们已经完全按照要求操作，但仍会偶尔出现污染。
不幸的是，即便遵循实验室操作规范，污染还会偶有发生。必须先确定污染类型及其来源，才能针对偶发性污染制定相应措施。污染源和传播方式五花八门，从实验室人员、未过滤的空气到所用的设备，都有可能成为污染源。所有试剂、培养箱和设备都有可能造成污染，需要对它们进行检测。建筑物内的空气质量也会引起污染问题。您可参阅文件CLS-CG-TS-077中的表格，其中列出了污染类型、可能的来源和疑难解析。
若培养物已被污染，是否有相应的拯救措施？我们最近发生了支原体污染，不知该努力拯救还是只能重新开始。
这主要取决于资源和时间。虽然可以挽救实验，但结果的可信度却很难保证。此外，挽救细胞需要一定的时间和资源，涉及方法/培养基/人员/使用的设备。最终的问题是：“所有这些努力值得吗？细胞培养数据可信吗？”重新开始可能需要一周甚至更长时间，但实验结果可靠，数据可用于发表。另一方面，如果是宝贵的原代细胞或其它有限的样本/试剂，则可能不得不采取挽救措施。
我们正在培养Vero细胞，并未观察到明显的污染迹象，但培养基耗竭的速度比预期快得多。请问我们是否应该进行检测？如果是，鉴于没有迹象可寻，能否推荐一项适用范围较广的检测。
这其中可能涉及两个问题。如果所说的“耗竭”是指培养基体积减少，这可能是蒸发的问题。如果“耗竭”是指营养素耗尽，原因有多种。如果属于这种情况，应检查培养箱的CO2和水含量，确保没有问题。如果排除了上述所有可能并怀疑发生污染，则可进行以下快速检测：
- 利用PCR和显微镜检查确保细胞形态和基因谱一致。
- 细菌：检查培养基是否浑浊以及pH值。
- 内毒素：鲎阿米巴样细胞溶解物 (LAL) 试验；
- 支原体：Hoechst染色
我们正在开发利用封闭式系统生产贴壁细胞的工艺。在将培养物添加至封闭式系统之前，应采取哪些步骤来确保其无污染。此外，培养过程中是否要进行检测，还是等到收集后再进行？需要在生产过程中的哪几个时间点进行污染检测？
生物负荷控制对于关键应用必不可少/至关重要，例如在药物生产工艺中。
除了在生产过程的最初阶段检测原材料和培养基的无菌性以外，还建议进行以下几项“过程检测”：
- 每次培养物传代时进行无菌检测。
- 接种至容器 (或用来完成最终生产步骤的大规模生物反应器) 之前进行接种物的无菌检测。
- 针对种子培养工艺建立培养物备份 (种子培养工艺 = 生成足够数量的细胞，用于生产用生物反应器接种。参考文献：Seed train optimization for suspension cell culture. T. Hernández Rodríguez et al. BMC Proc. 2013; 7(Suppl 6): P9.）
通常可以取一小份培养物样本，接种在胰蛋白胨大豆肉汤管 (或琼脂) 中。
该检测需要在37和25摄氏度下进行14天。鉴于在生产过程中难以实施为时14天的检测，可在现场进行至少24小时的接种物无菌检测。
此外，除了遵循培养箱标准操作步骤以确保培养箱无菌 (参见本页的问题1) 外，对于生物安全柜 (BSC) 内的开放式操作，建议如下：
- 在操作人员戴上无菌手套开始操作前直接对手套进行琼脂平板法检测
- BSC环境检测——在细胞培养过程中将打开的琼脂平板置于BSC中
康宁拥有多位现场应用科学家，他们在特定生物工艺和封闭式系统方面拥有大量丰富经验。若有其他应用方面的问题，请联系以下科学支持团队，他们会帮您联系当地的现场应用专员。美洲地区：Scientificsupport@corning.com，亚太区 (包括大中华区、东南亚、韩国、印度、澳大利亚和新西兰)：ScientificSupportAP@corning.com，EMEA地区 (包括欧洲、中东和非洲)：ScientificSupportEMEA@corning.com，日本：ScientificSupportJP@corning.com
我们遵循实验室现有细胞冻存方案进行操作，但仍发生了几次污染。能否为我们提供一份有助于降低冻存细胞污染可能性的核对表？
冻存前：
- 首先确保细胞处于最佳状态。选择接近对数生长末期的培养物 (约90%汇合)，收集前24小时更换培养基。仔细检查培养物是否出现微生物污染。可以在检测前使用不含抗生素的培养基培养数代。这会使那些隐藏的耐药性微生物 (数量极少) 达到更高的浓度，从而更容易检测出来。然后在显微镜下观察这些培养物样本，并通过直接培养检测其是否存在细菌、酵母、真菌和支原体。
- 支原体污染较为特殊，即便支原体在培养物中达到很高浓度 (高达108个/毫升培养基)，也无法观察到或造成培养基浑浊。因此，有多达20%的动物细胞培养物会被这些无处不在却无法观察到的微生物污染。尽管支原体检测需要采取特殊措施，但鉴于其存在会带来严重后果，绝对有必要对冻存培养物进行支原体检测
- 使用有助于温度稳定并降低温度波动的设备。康宁的样本冷却和加热解决方案可实现一致且可重复的标准化温度控制，不受冰、电源或电池限制。这种解决方案能够弥补温度调节方面的不足，降低污染风险，使样本在操作过程中保持冷却和稳定。
康宁样本冷却和加热系统手册 - 将细胞保存在采用特殊设计的冻存管内。管盖有多种样式可选，包括内旋盖和外旋盖，后者有助于最大程度减少污染。
冻存过程中：
- 液氮 (N2(l)) 冷冻装置可将冻存培养物保存在液氮上方的气相中 (温度为-140°C至-180°C)，或者浸于-196°C以下的液体中。使用气相液氮保存有助于大幅降低冻存管泄漏或安瓿取出时发生爆炸的可能性，因此建议采用该方法，以防止污染扩散。
- 如需有关细胞冻存的更多信息，您可：下载动物细胞冻存指南
- 还可查看冻存细胞核对表。
虽然我们的实验室尚未发生过污染，但我想知道如果出现污染，应该如何确保污染源已清除？
若出现污染，应彻底清洁培养箱、水浴箱、通风橱及其它工作表面，同时还要更换所有可能被污染的培养基或试剂，这样即可清除污染源。您可能终始无法找到确切的污染源，也可能没必要找到，但在之后的几周，应当密切关注培养物，并确保所有实验室人员均熟知并遵循安全操作流程。可能会有人发现一瓶培养基翻倒在水浴箱内却“认为问题不大”，或者匆忙中忘记戴手套或向工作表面喷洒消毒剂，又或者边更换培养基边接电话。在发生重大污染事件后，这个人会意识到这些疏忽可能就是造成污染的原因，以后避免再犯同样错误。对于偶尔想省事的实验室研究人员，他们最终会发现走捷径可能会引发重大问题。如果在第一轮污染清理结束后很快又出现第二轮污染，则需要重新培训所有实验室人员，再次检查所有培养基、试剂和冷冻的培养物，以确定污染原因。当有多位用户共用细胞培养空间时，沟通至关重要。
我虽然没发现细胞污染，但混入了其他细胞系，请问应该如何处理？
培养物交叉污染是由于不同细胞系意外混合在一起，其原因有多种，例如：交叉使用或共用不同细胞系的培养基，以及共用设备 (生物安全柜)。
方法：
- 在对进入实验室的所有培养物进行检测/检查之前，先隔离。开始培养的第一步是细胞鉴定，以确定细胞的种类和种属
- 定期检查细胞的形态或遗传学变化。进行细胞鉴定以确定细胞的种类和种属尤为重要
- 尽可能每次只操作一种细胞系
- 在将新细胞系放入层流通风橱之前和取出之后彻底清洁通风橱
- 每天用70%乙醇清洁通风橱内空间，每月用10%漂白剂或等效产品清洁一次
- 将冻存细胞系保存在气相液氮中，而不是液相液氮中
参考文件：细胞培养污染问题排查指南CLS-CG-TS-077
还可参阅——污染指南，这也非常实用。
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