高濃度コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法 | Corning

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高濃度コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

高濃度コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

高濃度コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

高濃度コラーゲン I (ラット尾) のコーティング方法

 

推奨コーティング方法

ゲル化法 1:

Corning® 高濃度コラーゲン I (ラット尾)は、下記の手順でpH がアルカリ性に傾いたときにゲル化します。アプリケーションに応じて最適なコーティング条件を決めるためのガイドラインとしてご使用ください。

1.      アンモニアを気化させる容器として、150 mm ディッシュのフタの内側に約5 cm の滅菌済みガーゼスポンジを貼り付けたものを用意します。ガーゼに水酸化アンモニウムを十分染み込ませます。150 mm ディッシュにふたを戻し、わきに置いておきます。

2.      コーティングしたい表面に、高濃度コラーゲン I (ラット尾)を均一にコートしてください。必要に応じてコーティングの厚みは変えることができます。22 mm のカバースリップをコーティングするには高濃度コラーゲン I (ラット尾)50~100 µL で十分です。100 mm ディッシュには、ディッシュ当たり約6.0 mL、60 mm ディッシュには約2.3 mL、35 mm ディッシュには約1.0 mLを加えてください。

3.      コーティングしたカバースリップやディッシュはふたをしないで1の容器にいれ、気化したアンモニアに3分間さらします。

4.      コーティングしたカバースリップやディッシュを30分間、滅菌蒸留水に浸します(35 mm ディッシュには5 mL、60 mm ディッシュには10 mLの滅菌蒸留水が目安です)。この蒸留水を吸引し、新たな0.5~1.0 mL の滅菌蒸留水に浸して、クリーンベンチ内で一晩静置します。

5.      滅菌蒸留水を吸引し、血清を添加した平衡塩類溶液に交換して2~8℃で保管します。

ゲル化法 2:

1.      下記を氷上に置きます。

1.1.     Corning高濃度コラーゲン I (ラット尾)

1.2.         滅菌済み10X リン酸緩衝食塩水 (10X PBS)

1.3.         滅菌蒸留水

1.4.         滅菌 1N 水酸化ナトリウム(1N NaOH)

2.      使用する高濃度コラーゲン I (ラット尾)溶液の最終容量と最終コラーゲン濃度を決めます。

3.      高濃度コラーゲン I (ラット尾) の最終容量が入る、十分な容量の滅菌済みのチューブを氷上に置きます。

4.      クラス 100 フード内で、下記のステップを滅菌操作で行います。

4.1.         下記の容量の10X PBS をチューブに入れます。

               画像

4.2.         使用する高濃度コラーゲン I(ラット尾)の量を計算します。(4.6 までチューブには入れません)

              画像

4.3.         10X PBS に下記の量の氷冷滅菌1N 水酸化ナトリウムを加えます。

               (加えるべきコラーゲンの量) x 0.023 mL = 1N NaOH

4.4.         10X PBS/1 N NaOH に下記の量の氷冷滅菌蒸留水を加えます。

               (最終容量)  -(コラーゲン量)-(10X PBSの量)-(1N NaOH)= 加えるべき滅菌水の量

4.5.         チューブの中身を混ぜ、氷上に置いておきます。

4.6.         計算した高濃度コラーゲン I (ラット尾)を加えて混ぜます。使用するまで氷上に置いておきます。

5.      高濃度コラーゲン I (ラット尾)溶液はすぐに使用することもできますし、氷上で2~3時間であればおいておくこともできます。

6.      使用する準備ができたら、準備した溶液を無菌的に細胞培養容器に移し、37℃で30分間ゲル化させます。