冷冻保存细胞会使其处于休眠状态，生物学时间停滞。这听起来像是科幻小说里的情节，但冻存的确是细胞培养过程中的重要一环，操作需要极其精确且谨慎。
那么我们应当如何冻存细胞？下面将分步进行说明。
第1步：选择细胞
当细胞处于最佳状态且接近对数生长末期时，就是冻存细胞的最佳时机。仔细检查培养物是否出现微生物污染。在检测前，使用不含抗生素的培养基培养细胞数代，可使本来可能无法检出的污染物更容易检测出来。
在显微镜下观察样本，然后通过直接培养检测是否存在细菌、酵母、真菌和支原体。支原体污染较为特殊，使用上述方法难以检测出来；需要在冻存后再次对冻存培养物进行检测。
第2步：收集细胞
应根据细胞类型采用适当的方法收集细胞——操作要尽量温和。收集细胞后，洗去或灭活会损伤细胞的解离试剂。仅在必要时使用离心机且操作要温和——尽可能减小离心力，能够形成柔软的沉淀物即可。
将待收集的培养容器中的所有内容物混合，以确保最终冻存细胞的均一性。根据需要稀释或浓缩细胞悬液，使其密度为目标浓度的两倍。
冷却细胞，减缓细胞代谢，防止聚集。必要时，可通入二氧化碳气体以调整pH值，防止偏碱性。
第3步：保存细胞
第4步：冷却细胞
冷却速率必须保持不变，且冷却不宜过快，以便细胞有足够的时间脱水，也不宜过慢，防止细胞因脱水而受到损伤。对于大多数的动物细胞，理想的冷却速率是保持在每分钟降温1°C至3°C。对于体积较大或渗透性较低的细胞，因其脱水时间更长，可能需要进一步降低冷却速率。
有些实验室使用可精确控制细胞冷冻过程的程序降温装置，以获得一致且可重复的结果。还有些实验室采用机械装置，以较低的成本实现上述过程的控制。最经济且最常用的细胞冻存方法是使用带聚苯乙烯泡沫盒的超低温冰箱。
第5步：保存细胞
细胞冷冻后，需要尽快转移。使用装有干冰或液氮的隔热容器进行转移，以便永久保存。要避免冻存管升温从而损伤细胞，速度至关重要。
大部分细胞培养实验室使用液氮冷冻装置，但无论选用哪种永久性冷冻保存场所，最重要的是将温度可靠地维持在-130°C以下。
第6步：解冻细胞
冷却细胞时必须逐步降温，而解冻细胞正好相反。快速解冻细胞有助于再水化时减少细胞内冰晶的形成，否则会造成细胞损伤。将容器置于温水中，轻轻搅拌，直至完全解冻。对于大部分细胞而言，在37°C下解冻60至90秒即可获得最佳结果。
第7步：复苏细胞
尽快去除细胞中的冷冻保护剂且操作要尽量温和，以免长时间暴露于冷冻保护剂而造成损伤。去除冷冻保护剂的方法取决于保护剂类型和细胞类型——例如，对冷冻保护剂敏感的细胞需要通过温和的离心来去除。当使用甘油作为冷冻保护剂时，在解冻的细胞悬液中突然加入大量新鲜培养基会损伤细胞或导致细胞死亡。为避免上述情况，应当每10分钟使用等量的预热培养基对细胞进行稀释，分几次逐步完成，让细胞有时间调整，然后再进行后续操作。
一般而言，如果能在解冻后6至8小时内更换培养基，去除冷冻保护剂，大部分细胞均可正常复苏。
细胞成功冻存后，几乎无需维持，当细胞出现污染或意外时，可以随时取用。冻存细胞对于长期实验尤为有用，其休眠状态有助于确保生物学变异处于最低水平。
联系我们