Adherent Cell Culture | Overcoming the Challenges of Scaling Up Adherent Cells | Corning

下文最初发表于2021年3月1日的Biocompare上,点击此处可查看。

贴壁细胞通常在细胞培养皿或培养瓶表面培养。气体和营养物质交换需要通过培养基进行,因此必须全面优化培养条件,以便支持细胞生长。贴壁细胞培养存在贴壁不佳、产量或活性下降以及生成不均匀的细胞单层等问题,在细胞扩增过程中,这些影响会更加明显。本文重点介绍了在常规细胞培养和大规模培养过程中出现上述问题的常见原因,并就如何防止这些问题发生给出了实用建议。

贴壁细胞培养时遇到的挑战

贴壁细胞培养的主要挑战在于使细胞贴附于培养器皿上。当细胞在减血清或无血清培养基中生长时,这个问题尤为严重,因为血清中的粘附蛋白 (玻连蛋白和纤连蛋白) 通常是细胞粘附和伸展所必需的。另一项挑战是要确保为细胞提供充足的氧气和营养物质,以免细胞活性下降或造成表型改变,进而影响下游应用。此外,细胞单层必须均匀分布。细胞均匀分布不仅有助于促进细胞稳定生长,还可最大程度增加从培养器皿中收集的细胞数量。

防止出现常见生长问题

采用贴壁细胞培养操作规范可以轻松克服上述挑战。通过几次细胞传代使其适应减血清或无血清条件,或者使用表面经特殊处理的培养器皿可以促进细胞贴壁。应当根据细胞类型仔细选择有效的包被,包括多聚-L-赖氨酸、明胶、胶原蛋白以及各种专利配方。通过预热和预充气使培养基达到合适的pH值也可以促进细胞粘附,尤其是使用较大的培养器皿时。

器皿大小和培养基体积会对贴壁细胞的气体交换和氧气供应产生显著影响,因此必须仔细优化培养基的高度。培养基的高度不能过高,这样氧气才能在顶部空间和细胞之间自由流通,同时又不能过低,以便有足够的营养物质支持细胞健康生长。在贴壁细胞培养时,一般建议每cm2生长面积使用0.2–0.4 mL培养基。

为了避免形成不均匀的单层,细胞接种物在加入培养器皿后应与培养基进行充分而温和的混合。可以小心地多角度倾斜培养皿或使用宽口血清移液管慢慢吹打几次。更换培养基或在生物安全柜和培养箱之间移动培养细胞时,还应避免产生剪切力。当培养基从细胞上扫过时,会发生剪切力,导致细胞单层解离。轻柔的操作可以避免上述问题,还有助于防止气泡形成,而气泡会阻止新接种的细胞贴壁或导致已贴壁的细胞坏死。

采用操作规范进行大规模培养

研究人员进行贴壁细胞大规模培养的原因有多种,包括生成细胞裂解液用于免疫分析 (如蛋白质免疫印迹或ELISA)、在单克隆抗体开发过程中扩增可生成抗体的克隆,以及生产各种细胞治疗产品。不论最终目的是什么,在大规模培养时,随着器皿尺寸增加,细胞仍应保持稳定生长;这是确保细胞特性不变的关键。

大规模培养操作一般是先将细胞从多孔板转移至细胞培养皿中,然后再转移至培养瓶中,最后在多层培养瓶中进行培养。多层培养瓶旨在最大限度提高产量,且不会占用过多的CO2培养箱空间,目前有些多层培养瓶能够培养多至10层贴壁细胞,占用空间却与普通175 cm²培养瓶相同。这类产品包括Falcon® 多层细胞培养瓶 (525 cm2和875 cm2) 以及Corning® HYPERFlask® 细胞培养器皿 (1720 cm²)。如需进一步扩大培养规模,还可以选择转瓶 (至多1,750 cm²)、康宁CellSTACK® 培养室 (至多25,440 cm²) 以及可与生物反应器相连的高度精密的封闭灌注系统 (至多85,000 cm²)。

值得注意的是,可以在大规模培养之前使用较小的器皿对培养条件进行全面优化。例如,可使用多孔板或培养皿比较不同的培养基配方,或确定最佳接种浓度,然后再将细胞转移至较大的器皿中培养 (如培养瓶)。在整个扩增过程中,培养基的体积应保持恒定 (mL培养基/cm²),以免在大规模培养时带来更大的实验差异。

康宁可提供适用于贴壁细胞培养的各种器皿,包括多孔板、培养皿以及单层和多层培养瓶。如需了解更多信息,请访问我们的细胞培养解决方案