Protocolos de Cultura Celular em 3D de Esferoides
Sherman também explicou que nenhum protocolo de cultura celular 3D de esferoides atenderá as necessidades de todos os laboratórios, e muitas vezes há a necessidade de equilibrar diferentes considerações. Os laboratórios devem considerar o tipo de célula com o qual estão trabalhando, o método de análise, o quanto de uniformidade eles precisam em relação ao tamanho e forma dos esferoides e o quanto de sinalização é necessário.
Uma opção tradicional é incorporar as células dentro de um hidrogel, como a matriz Corning® Matrigel® "Pense em frutas dentro de uma gelatina, dessa forma a matriz mantém as células aprisionadas e encapsuladas", disse Sherman.
Mais recentemente, alguns laboratórios passaram a cultivar esferoides em superfícies de baixa aderência, como a superfície de Ultra-Baixa Adesão (ULA) da Corning. Como as células não conseguem se fixar nessas superfícies, elas tendem a se agregar e formar esferoides.
Protocolos de Cultura Celular 3D de Organoides
Organoides tendem a ter requisitos mais específicos do que esferoides em termos de fatores de crescimento e proteínas, e a maioria da cultura de organoides é feita através do seu encapsulamento em uma matriz extracelular (ECM). Isso ocorre em parte porque os organoides possuem polaridade, em decorrencia a diferença dos tipos de células da parte interna e externa.
"A maioria dos pesquisadores que cultivam organoides deseja que eles estejam na orientação apropriada, e dessa forma a superfície de Ultra-Baixa Adesão (ULA) sozinha não é suficiente. É necessário usar ECM e ULA, ou apenas ECM", disse Sherman.
A maneira mais simples de obter isso é misturando as células com a matriz de Matrigel e colocando-as em uma placa para que se distribuam pelo hidrogel. Sherman mencionou que, embora essa seja uma boa maneira de produzir organoides em maior quantidade, pode ser mais difícil de realizar imagens, pois os organoides estão em diferentes planos focais.
Em vez disso, alguns pesquisadores cobrem uma placa com matriz de Matrigel primeiramente, criando uma camada plana e espessa. Em seguida, as células do organoide são adicionadas por cima em uma mistura mais diluída com a matriz de Matrigel. Essa técnica é chamada de "cultura em sanduíche". Embora exija múltiplas etapas para configuração, ela simplifica a realização de imagens, pois os organoides estão em um único plano focal.
Outra opção é o ensaio em formato de cúpula ou ensaio em gotas, uma técnica na qual pequenas gotas (5-10 uL) de hidrogel misturado com células são colocadas em uma superfície. O baixo volume força os organoides a estarem em um campo de visão estreito para a realização de imagens, mas requer um processo simples de semeadura. Sherman mencionou que, como apenas um pequeno número de células é necessário para semear as pequenas gotas, essa técnica é especialmente vantajosa ao trabalhar com organoides preciosos, como aqueles derivados das células de um paciente.
Uma técnica mais recente, que foi demonstrada com vários tipos de organoides, é a utilização de um produto com superfície ULA e utilizando o Matrigel como suplemento no meio de cultura. A superfície de Ultra-Baixa Adesão mantém as células sem se fixarem, e o Matrigel sinaliza para os organoides se desenvolverem na orientação correta. Isso pode reduzir os custos, pois apenas uma solução diluída de Matrigel é utilizada, além de equilibrar as necessidades de imagens e simplicidade dos laboratórios.
Solução de problemas em culturas de esferoides e organoides
Devido aos requisitos específicos das culturas 3D, os procedimentos para culturas de esferoides e organoides podem precisar de mais otimização em comparação a culturas 2D. Aqui estão algumas considerações para solução de problemas.
Uniformidade das suspensões celulares
Sherman explicou como a falha em manter as suspensões celulares devidamente misturadas durante o processo de semeadura das placas pode levar a esferoides não uniformes. "Se você tiver uma suspensão celular heterogênea, as células vão pousar onde caírem. Então, se você tiver um aglomerado de células que caem em um poço vs uma única célula que cai em outro poço, você pode obter esferoides de tamanhos diferentes. Para todos os protocolos de esferoides, é realmente importante começar com uma suspensão uniforme."
Otimização Requerida pelos Organoides
Sherman também observou que, quando os organoides são cultivados a partir de células derivadas de pacientes, cada linhagem celular precisa ser testada para determinar a densidade e o tamanho ideal para a fragmentação dos organoides durante as passagens, pois esses fatores têm um grande impacto na viabilidade. "Cada linha de organoide de um paciente vai se comportar de forma um pouco diferente, mesmo que seja do mesmo órgão", disse ela.
Para os esferoides também, os pesquisadores devem otimizar a densidade de semeadura para controlar o tamanho final dos esferoides. "Um esferoide maior terá maiores necessidades de nutrientes, então as trocas de meio de cultura precisarão ser mais frequentes, e isso pode começar a afetar a viabilidade", explicou Sherman. "É importante garantir que suas células recebam os nutrientes adequados e não acumulem resíduos".
Considerações sobre lise e imagem
Ao passar da cultura 2D para a 3D, os pesquisadores devem estar cientes das considerações sobre lise e imagem. Por exemplo, é mais difícil lisar uma estrutura 3D do que uma estrutura 2D.
Existem kits comerciais de lise celular disponíveis que contêm compostos líticos mais fortes para células 3D, de modo que o esferoide inteiro possa ser lisado antes da análise. Para a imagem celular, os cientistas devem considerar que pode levar mais tempo para que os corantes penetrem e para que a fixação ocorra em estruturas 3D em comparação com as 2D.
Avanços recentes e aplicações do mundo real da cultura 3D
Avanços recentes estão levando a novas aplicações no campo da cultura celular 3D. Aqui estão algumas áreas de pesquisa ativa.
Organoides invertidos
Um desenvolvimento interessante nas técnicas de cultura de organoides envolve o cultivo de organoides com polaridade invertida. Sherman explicou: "Com um organoide das vias aéreas, se ele for cultivado usando Matrigel para ter a mesma orientação que teria no seu corpo, você não terá acesso aos cílios, porque eles estarão no interior do organoide. Mas quando você os cultiva em ULA, eles realmente se invertem, de modo que os cílios ficam do lado de fora." Organoides intestinais também podem ser cultivados com orientação invertida para facilitar o acesso às células de interesse.
Em um artigo publicado na revista Viruses, cientistas criaram um modelo de organoide das vias aéreas invertido e o utilizaram para modelar a infecção pelo SARS-CoV-2 nos pulmões. A técnica também poderia ser aplicada para estudar outras doenças respiratórias.
Esferoides para Toxicologia
Os esferoides não são utilizados apenas em pesquisas sobre câncer; eles também estão sendo empregados em estudos de toxicologia. "Células primárias do fígado podem ser cultivadas como esferoides e mostram maior sensibilidade do que as culturas tradicionais em 2D (em estudos de toxicologia)", disse Sherman. "Você também pode co-cultivar múltiplos tipos celulares primários que seriam encontrados no fígado para criar um modelo mais complexo. Não é um organoide, mas é um esferoide muito mais complexo."
Alguns laboratórios estão utilizando esferoides de fígado para testar candidatos a medicamentos quanto a possíveis efeitos hepatotóxicos e investigar mecanismos de toxicidade que são difíceis de estudar em 2D.
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