Publicado em 25 de maio de 2022
A cultura de células é um trabalho árduo. Por ser um processo altamente técnico, há muitas coisas que podem dar errado ao transferir células de uma fonte para manipulá-las em outro ambiente, desde contaminação até crescimento insatisfatório.
Mas também há muitas coisas que podem dar certo. Ao longo dos últimos 100 anos, experimentos de cultura de células adesivas contribuíram para alguns dos avanços mais revolucionários na medicina moderna, aprimorando nossa compreensão de doenças como o câncer e apoiando o desenvolvimento de terapias seguras e eficazes.
Felizmente, hoje sabemos muito mais sobre a cultura de células do que quando o pioneiro da in vitro, Ross Harrison, analisou tecido de um sapo em uma lâmina de vidro no início de 1900. Neste guia, compartilhamos os fundamentos aprendidos ao longo de mais de um século de experimentação com células vivas, incluindo como semear, expandir e colher culturas de células.
How to Create an Ideal Environment for Growing Cells
Semeadura de células a partir de um estado criogênico
Ao adquirir linhagens de cultura de células, os produtos são fornecidos criopreservados, o que é necessário para manter a viabilidade das células a longo prazo. A partir desse estado, você precisará descongelar e semear as células, o que não deve ser apressado, mesmo que aconteça rapidamente. No entanto, esse passo importante muitas vezes é apressado e às vezes negligenciado, o que aumenta o risco de contaminação e não proporciona às células um bom começo estéril que elas precisam.
Aqui está a maneira correta de realizar o processo de semeadura de células:
- Prepare todos os seus materiais. Você precisará do frasco criopreservado, um recipiente ou banho pré-aquecido e um frasco com meio pré-equilibrado. Você também precisará de um frasco cônico cheio de meio caso deseje centrifugar as células para remover o DSMO ou outro crioprotetor.
- Aqueça o frasco. Mexa suavemente o frasco criopreservado no recipiente com água pré-aquecida até que o conteúdo esteja quase completamente descongelado. Em seguida, limpe o frasco com um lenço embebido em álcool para reduzir o risco de contaminação.
- Semeie suas células. Usando uma pipeta, remova as células do frasco criopreservado e transfira-as para o frasco. Em seguida, pipete a solução para cima e para baixo no frasco para misturar a solução para facilitar a semeadura. Com isso, suas células estão descongeladas, transferidas e prontas para o incubador (ou para a centrifugação para remoção do DSMO).
Expansão celular em escala
Quando chegar a hora de expandir suas células, você precisará adotar a abordagem correta de expansão celular. A expansão celular é uma parte necessária da cultura de células que depende tanto da eficiência quanto da consistência. Se você seguir um fluxo de trabalho ineficiente, provavelmente aumentará os custos de suprimentos e mão de obra. Se você seguir um fluxo de trabalho inconsistente, poderá estressar demais as células e matá-las.
Encontrar o equilíbrio certo dependerá da escolha do recipiente. Opções de camadas múltiplas, como a Corning® HYPERFlask®, podem ajudar os cientistas a estabelecer condições favoráveis para um crescimento mais rápido em um espaço menor, além de exigir menos trabalho e risco de contaminação.
Como nem todos os recipientes possuem a mesma área de crescimento, os pesquisadores geralmente pensam em termos de rendimento de células/cm2 ao determinar sua escolha de recipiente e a quantidade de reagentes associados. Eles então usam isso para evoluir consistentemente seu "seed train" (células iniciais) na quantidade de células necessárias pelo pesquisador. Para um crescimento ideal, mantenha a mesma proporção de células/cm2 e mL/cm2 em todos os recipientes e reagentes seguindo os seguintes passos:
- Aplique esta fórmula para calcular suas células por recipiente: [(células desejadas/cm2)*(cm2 do recipiente)].
- Aplique esta fórmula para calcular seu meio por recipiente: [(mLs desejados/cm2)*(cm2 do recipiente)]. Para um crescimento celular ideal e difusão de gases, a maioria das aplicações exigirá entre 0,2 mL e 0,5 mL de meio por cm2.
Colheita de suas células aderentes
Você saberá que as células estão prontas para a colheita quando elas aparecem como uma monocamada em toda a cultura sob o microscópio. Nesse momento, os cientistas geralmente removem as células por meio de métodos químicos ou físicos.
A remoção química por meio de agentes de dissociação precisa ser otimizada para o tipo de célula e aplicação, a fim de garantir que as células não sejam prejudicadas pelo reagente. Por outro lado, a remoção física por meio de raspadores de células pode ser a melhor opção para células fortemente aderentes e sensíveis que podem não tolerar agentes de dissociação. Considere também sua aplicação posterior e como ou se o reagente de dissociação pode afetar seus estudos.
Se você optar por usar agentes de dissociação, siga este processo de forma asséptica usando uma pipeta:
- Remova o meio de cultura do frasco.
- Adicione uma solução de tampão, como PBS, ao frasco para remover quaisquer vestígios de soro que possam interferir no agente de dissociação. Mexa suavemente o recipiente para uniformizar a solução internamente. Deixe de molho por 10 a 15 minutos para linhagens de células de difícil desprendimento. Remova a solução tampão.
- Adicione o agente de dissociação a 0,02 a 0,03 mL/cm2. Dependendo da linhagem de células ou do agente de dissociação, você pode querer incubar o recipiente a 37°C para promover a dissociação.
- As células estão prontas quando parecem arredondadas, mas ainda não aglomeradas - quase como se você estivesse olhando para um céu noturno cheio de milhares de estrelas. A turvação do líquido é um bom sinal de que elas se desprenderam e estão prontas.
- Dilua o agente de dissociação, geralmente em uma proporção de 1:1 com a solução tampão ou meio de cultura contendo soro. Pipete para cima e para baixo algumas vezes antes de remover toda a solução e transferi-la para o tubo.
- Finalize com centrifugação caso as células forem especialmente sensíveis ao reagente.
Agora suas células estão prontas para a contagem, para que você possa medir a densidade celular e a viabilidade.
Tornando a Cultura de Células Funcional para Você
As culturas de células aderentes podem abrir um mundo totalmente novo de experimentação e aplicações posteriores no seu laboratório - e também podem ser divertidas. Mas pode haver muito em jogo quando você está manipulando células vivas, então é importante fazê-lo corretamente. Seguindo essas dicas essenciais e avançando para protocolos mais avançados, você pode se tornar um especialista em cultura de células em pouco tempo.