Corning Transwell Cell Migration Assay Ultimate Guide

Passo a Passo para os Ensaios com o Suporte Permeável Transwell

Aqui está um procedimento geral para a execução fácil do ensaio, que pode ser variado de acordo com suas necessidades específicas:

1. Utilizando técnica asséptica, cultive as células ou esferoides cuja migração ou invasão deseja testar.
2. Se estiver realizando um ensaio de invasão, siga as instruções do fabricante para reconstituir ou preparar uma matriz extracelular.
3. Se estiver realizando um ensaio de invasão, use uma seringa ou pipeta estéril para aplicar a matriz extracelular em cada inserto (exceto nos insertos de controle não revestidos), minimizando o contato com as paredes laterais. Siga as instruções do fabricante para permitir que a matriz extracelular se forme em um gel. Alternativamente, use opções pré-revestidas e pré-montadas, como as câmaras de invasão Corning BioCoat® ou os suportes permeáveis Transwell.
4. Prepare suspensões celulares. Semeie as suspensões de células ou esferoides em cada câmara superior com a densidade de células e volume desejados.
5. Coloque os atrativos desejados nas câmaras inferiores, utilizando o meio apropriado.
6. Incube pelo tempo desejado.
7. Colete ou fixe, core e crie a imagem das células migradas ou invadidas para quantificar a migração ou invasão.Para células não aderentes, remova os insertos Transwell e colete as células no poço inferior da placa complementar. Em seguida, conte ou core e faça a imagem das células utilizando o método de sua preferência. 

• Para células não aderentes, remova os insertos Transwell e colete as células no poço inferior da placa complementar. Em seguida, conte ou core e faça a imagem das células utilizando o método de sua preferência.
• Para células aderentes, um método econômico é remover as células não invadidas ou não migradas, esfregando suavemente, mas firmemente, a superfície superior do inserto com um cotonete umedecido com PBS. Em seguida, fixe e core as células que migraram para a face inferior da membrana.
• Um método potencialmente mais rápido para células aderentes é dissociar as células da face inferior da membrana e usar um método apropriado de quantificação (por exemplo, Calcein AM).
• A quantificação pode ser realizada por microscopia com captura de imagem, microscopia com contagem direta de células, citometria de fluxo, contagem com hemocitômetro ou uso de leitor de placa. Se estiver usando microscopia, certifique-se de incluir campos suficientes próximos ao centro e às bordas do inserto.
• Para ensaios de invasão, calcule a porcentagem de invasão dividindo o número médio de células invadidas pelo número médio de células migradas através de membranas de controle não revestidas e multiplicando por 100.

Solução de problemas em ensaios de migração e invasão celular

Ensaios de migração e invasão são complexos, e muitas vezes é necessário otimizar vários aspectos de um ensaio de migração em suporte permeável Transwell. Aqui estão algumas considerações: 

• Escolha o tamanho adequado de poros para as células que você está estudando. Procure um tamanho de poro pelo qual as células migratórias possam passar, mas não caiam através dele - e que seja o mais relevante possível para o sistema biológico que você está estudando.
• A porcentagem de migração medida pode ser imprecisa em densidades de semeadura baixas ou altas, devido a problemas como saturação excessiva dos poros, saturação excessiva da sinalização do ensaio ou, inversamente, o tamanho reduzido da amostra. Realize uma titulação usando um quimoatraente conhecido para determinar a densidade celular ideal para o seu experimento.
• Além disso, tente titular a concentração do quimoatraente e o tempo de migração para o seu experimento. Considere testar diferentes quimoatraentes e barreiras de invasão.
• Certifique-se de incluir controles adequados. Isso ajudará você a detectar quando algo deu errado e decidir como corrigir o problema. Por exemplo, em ensaios de invasão, inclua uma linhagem celular de baixa invasão como controle, isso pode ajudar a confirmar que a barreira da matriz extracelular é eficaz em impedir o movimento de células não invasivas ou pouco invasivas. Inclua uma placa de controle com as células experimentais e sem revestimento de matriz extracelular isso permitirá calcular a porcentagem de invasão. Inclua uma placa sem um quimoatraente e uma placa com um quimoatraente conhecido como controles negativo e positivo, respectivamente, pode ajudar a otimizar e solucionar problemas em ensaios de migração.
• Certifique-se de que as células não estejam danificadas antes de semear nos insertos de cultura celular. Alguns métodos de colheita (como o uso de tripsina) podem danificar receptores e tornar as células menos sensíveis ao quimioatraente. Se as células não estiverem migrando adequadamente, tente privá-las de soro por 24 a 48 horas para aumentar sua sensibilidade ao quimoatraente.   

Produtos para Ensaio de Migração e Invasão de Células da Corning

Os produtos da Corning podem suportar uma ampla variedade de ensaios de invasão e migração, incluindo os suportes permeáveis Transwell com diferentes tamanhos de poro, formatos, materiais de membrana, áreas de crescimento e revestimentos.

A Corning oferece ferramentas e protocolos confiáveis para pesquisas sobre metástase do câncer, incluindo produtos líderes para ensaios de intravasação e extravasação. Entre em contato hoje mesmo para saber mais.